右美托咪定对脾切除术后老年大鼠海马长链非编码RNA BACE1-AS 的影响

周晓娜 殷税香 陈佳 方华 张伟晶 林洁如 章放香

1贵州省人民医院麻醉科（贵阳550002）；2安顺市西秀区人民医院麻醉科（贵州安顺561000）

围术期神经认知障碍（PND）是一种在麻醉与手术后通过神经心理学测试认知功能的疾病，其很难区别是因为麻醉后手术引起还是单纯麻醉引起的，主要表现为思维轻度的紊乱，如言语的记忆、视觉的记忆、语言理解、注意力、集中力等［1］。随着医疗科技的发展，手术适应症的不断拓宽，越来越多的老年人需要采取手术治疗，但随之而来的PND 高发病率成为一个亟待解决的问题。长链非编码RNA（lncRNA）是长度大于200 个核苷酸的非编码RNA，其在表观遗传调控和细胞周期调控等众多生命活动中发挥重要作用［2］。BACE1的反义链转录形成lncBACE1-AS，其可与BACE1 mRNA形成双链结构复合物，避免了BACE1 mRNA 被核酸酶降解，增加BACE1 mRNA 稳定性。有研究显示lncRNA BACE1-AS 通过NF-KB 调节使β 淀粉样蛋白（Aβ）在脑组织内沉积［3］。右美托咪定是一种高选择性α2-肾上腺素能受体的激动剂，可通过抑制儿茶酚胺的分泌和释放，抑制外科手术的应激反应［4］。研究表明，右美托咪定可通过下调炎性因子的表达及Aβ 的水平从而降低老年患者PND 的发生率［5］。但右美托咪定是否通过改变lncRNA BACE1-AS 从而改善老年患者术期神经认知障碍国内外尚无相关研究，因此，本实验旨在探讨右美托咪定能否通过调控海马lncBACE1-AS 改善老龄大鼠PND，为临床患者PND 治疗提供新的治疗措施。

1 材料与方法

1.1 材料实验动物的应用及实验程序得到贵州省人民医院实验动物中心实验动物应用管理委员会同意，由重庆第三军医大学动物实验中心提供研究动物［许可证号：SCXK（渝）2012-0005］，健康清洁级雄性SD 大鼠180 只，18月龄，体质量400～540 g，采用随机数字表法将研究动物分为5 组（n = 36）：对照组（C 组）、假手术组（D 组）、手术组（O 组）、生理盐水组（S 组）、右美托咪定组（Y组）。C 组不给予任何处理，D 组腹腔麻醉后切皮但不实施手术，O 组给予同样的麻醉后行脾切除术，Y 组给予同样的麻醉后，于切除脾脏前5 min腹腔注射50 μg/kg 右美托咪定；S 组腹腔注射等量生理盐水。于术后1、3、7 d 水迷宫测试结束后处死各组大鼠。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备参照文献［6］实施腹部手术制备大鼠PND 模型，大鼠腹腔麻醉后，待翻正反射消失将大鼠仰卧位固定，在大鼠肋缘下腹中线左旁开1 cm 消毒后切开1.5～2.0 cm 切口，进入腹腔游离脾脏，在脾蒂远端根部用3 号丝线结扎脾动脉、静脉，完全摘除脾脏并确定无残余脾组织。彻底止血后用碘伏消毒伤口，用0 号线逐层关腹。术毕腹腔内给予青霉素预防伤口感染，缝合切口，依次缝合腹膜、肌肉和皮肤，用无菌敷料贴覆盖，胶布固定，大鼠苏醒后放回鼠笼各自饲养，待用。

1.2.2 Morris 水迷宫测试该实验用于测量大鼠的空间学习和记忆能力。训练大鼠使用游泳池外的一组固定线索找到一个水下合并平台。大鼠连续5 d 每天接受4 次训练试验。在每次实验中，老鼠被温和地放置在面对迷宫墙壁的水中，位置是四等距的起始位置之一（北、南、东或西）。定位航行实验于建模前一周进行，在安静暗室内，大鼠在平台上适应30 s，然后从4 个不同象限将大鼠面向池壁放入池内，游泳时限设置为60 s，大鼠入水后至找到平台所用的时间，即为逃避潜伏期（电脑自动记录）。同时测定大鼠2 min在水迷宫中游泳路径。测试完成后各组大鼠进行相应处理。

1.2.3 HE 染色观察脑组织病理学变化于术后1 d 水迷宫测试结束后，每组随机选取3 只大鼠，麻醉后迅速置于冰上断头，脑组织浸泡于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中固定过夜。常规酒精脱水、石蜡包埋。在大鼠海马齿状回平面连续冠状切片，片厚5 μm，贴片后常规脱蜡水化，苏木精-伊红染色，光镜下观察各组大鼠海马CA3 区脑组织病理学变化。

1.2.4 实时荧光定量PCR 法测定lncRNA BACE1-AS 和BACE1mRNA 的表达于术后1、3、7 d 水迷宫测试结束后随机取11 只大鼠，分离海马组织，-80 ℃冰箱保存。海马置于玻璃匀浆器中，加入1 mL Trizol 进行研磨，充分研磨后倒入1.5 mL EP 管，向其中加入200 μL 三氯甲烷，剧烈震荡15 s后室温静置2～3 min，12 000 转/min，离心半径为8 cm，离心15 min，取上清，加入等量异丙醇上下颠倒混匀，12 000 转/min，离心半径为8 cm，离心10 min，弃上清，加入1 mL 无水乙醇，12 000 转/min，离心半径为8 cm，离心5 min，弃上清，加入40 μL DEPC 水充分混匀后即为总RNA，进行RNA样品的纯度、浓度和完整性鉴定；应用逆转录试剂盒（Thermo 公司，美国）进行逆转录，以总RNA 为模板逆转录合成cDNA，引物设计：lncRNA BACE1-AS 上游引物：5′-CCTCCACCGTCCCGAGTT-3′，下游引物：5′-AGATGAAGGAACTGAGGC-3′；BACE1 mRNA 上游引物：5′-TGTTGGTCAGGCTGGTCT-3′，下游引物：5′-CGCGTACAACTATGACAAGAGC- 3′；β-actin 为内参照物。RT-PCR 采用RT-PCR 试剂盒（北京天根公司），反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性20 s，56 ℃退火20 s，75 ℃延伸30 s，40个循环，75 ℃延伸7 min，结束反应。取10 μL PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳，通过Image-pro plus 6.0软件（Media Cybernetics 公司，美国）分析积分光度密度值反映lncRNA BACE1-AS 和BACE1mRNA 的相对表达水平。

1.2.5 蛋白印迹法（Western-blot）检测Aβ、APP及BACE-1的表达测定蛋白浓度，加入5×上样缓冲液100 ℃变性5 min。-20 ℃冻存电泳完毕将胶上的蛋白转移到PVDF 膜（Millipore 公司，美国）上，然后用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，取出膜，于摇床上用TBST 洗膜5 min × 3 次。孵育袋中加入封闭液稀释的兔多克隆抗体（稀释度1∶1 000，Biorbyt公司，英国）、兔HO-1 多克隆抗体（稀释度1∶800，Santa Cruz 公司，美国）、兔NQO1 多克隆抗体（稀释度1∶1 000，Biorbyt 公司，英国）、β-actin（稀释度1∶2 000，Santa Cruz 公司，美国），4℃孵育过夜。TBST 洗膜5 min×3 次，辣根过氧化物酶标记的二抗（稀释度1∶2 000，Jackson 公司，美国）室温孵育2 h。TBST 洗膜15 min × 5 次。膜于化学发光检测试剂（试剂A∶试剂B=1∶1）反应2 min，取出膜，甩去多余的液体，用保鲜膜包好PVDF 膜。暗室中用X 胶片感光、显影、定影。蛋白条带灰度的定量分析运用凝胶图像Image J 软件（NIH 公司，美国）分析目的蛋白条带灰度值，以其与内参β-actin 条带灰度值的比值反映Aβ、APP 及BACE-1 的表达水平。

1.3 统计学方法采用SPSS 20.0统计学软件包对所有数据进行处理，所有符合正态分布的计量资料以表示，多样本均数间的两两比较的计量资料采用单因素方差分析，所有重复测量设计的计量资料采用重复测量设计的方差分析，所得计数资料比较采用χ2检验，P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Morris 水迷宫测试逃避潜伏期和游泳路径与对照组、假手术组比较，模型组、生理盐水组大鼠术后1、3、7 d 逃避潜伏期和游泳路径延长，经右美托咪定治疗后大鼠术后1、3、7 d 逃避潜伏期和游泳路径缩短，差异均具有统计学意义（P ＜0.05）。与术前比较，模型组、生理盐水组和右美托咪定组术后逃避潜伏期和游泳路径延长；术前各组、对照组与假手术组，模型组与生理盐水组大鼠逃避潜伏期和游泳路径比较差异无统计学意义。见表1。

表1 五组大鼠术后各时点逃避潜伏期和游泳路径的比较Tab.1 Comparison of the escape latency and swimming distance at different points among five groups ±s

表1 五组大鼠术后各时点逃避潜伏期和游泳路径的比较Tab.1 Comparison of the escape latency and swimming distance at different points among five groups ±s

注：与C 组、D 组相比，aP ＜0.05，与O、S 组相比，bP ＜0.05

组别C 组D 组0 组S 组Y 组逃避潜伏期（s）术前（n=36）18±6 18±8 18±6 18±9 18±7术后1 d（n=11）18±7 18±9 79±8a 77±9a 37±6ab术后3 d（n=11）18±7 18±5 82±9a 78±7a 35±7ab术后7 d（n=11）18±6 18±7 81±8a 79±8a 34±5ab游泳路径（cm）术前（n=36）158±12 156±9 155±8 154±8 155±7术后1 d（n=11）155±11 154±10 769±29a 778±27a 367±22ab术后3（n=11）156±10 157±11 758±27a 767±26a 347±21ab术后7 d（n=11）1 567±9 158±9 728±26a 756±24a 317±20ab

2.2 观察大鼠术后1 d 海马组织CA3 区病理学变化HE 染色高倍镜下观察C 组、D 组大鼠海马CA3 区锥体细胞线清晰，细胞形态规则，细胞排列整齐又密集，胞核和胞质清晰，细胞核又大又圆，呈均匀淡蓝色或蓝色，细胞核仁清晰，细胞质丰富。O 组大鼠海马CA3 区锥体细胞线不完整、细胞周围出现间隙，且许多细胞胞体缩小、细胞胞浆呈淡红色、细胞胞核固缩、深染，仅呈很淡的蓝色甚至蓝色消失。Y 组海马CA3 区锥体细胞介于正常C 组和O 组之间，海马内核固缩现象明显减轻，锥体细胞排列较O 组整齐，形态较O 组正常。O 组与S 组类似，见图1。

图1 各组大鼠海马CA3 区HE 染色结果Fig.1 HE staining in the hippocampal CA3 region of rats in each group（×400）

2.3 RT-PCR 法测定大鼠术后各时点海马lncRNA BACE1-AS 和BACE1 mRNA 的表达与C组、D 组比较比较，O 组、S 组和Y 组大鼠术后各时点海马lncRNA BACE1-AS 和BACE1 mRNA的表达上调，与O 组，S 组比较，Y 组大鼠术后各时点海马lncRNA BACE1-AS 和BACE1 mRNA的表达下调，P ＜0.05。C 组与D 组和O 组与S组大鼠术后各时点海马lncRNA BACE1-AS 和BACE1 mRNA 的表达比较差异无统计学意义。见表2。

表2 五组大鼠术后各时点海马lncRNA BACE1-AS 和BACE1mRNA 的表达水平比较Tab.2 Comparison of the expression levels of lncRNA BACE1-AS and BACE1 mRNA at each point between the five groups ±s

表2 五组大鼠术后各时点海马lncRNA BACE1-AS 和BACE1mRNA 的表达水平比较Tab.2 Comparison of the expression levels of lncRNA BACE1-AS and BACE1 mRNA at each point between the five groups ±s

注：与C 组、D 组比较，*P ＜0.05；与O 组、S 组比较，#P ＜0.05

组别C 组D 组0 组*S 组*Y 组*#lncRNA BACE1-AS术后1 d 0.56±0.04 0.57±0.03 1.95±0.13 1.87±0.12 1.15±0.08术后3 d 0.55±0.05 0.53±0.04 1.82±0.12 1.89±0.13 1.17±0.09术后7 d 0.54±0.04 0.55±0.05 1.85±0.14 1.83±0.12 1.12±0.07 BACE1 mRNA术后1 d 0.35±0.04 0.36±0.05 0.89±0.08 0.66±0.06 0.87±0.07术后3 d 0.36±0.05 0.35±0.04 0.91±0.09 0.64±0.07 0.86±0.08术后7 d 0.35±0.04 0.37±0.05 0.87±0.08 0.62±0.05 0.89±0.07

2.4 Western-blot 法测定大鼠术后各时点海马Aβ、APP、BACE1 的表达与C 组、D 组比较比较，O 组、S 组和Y 组大鼠术后各时点海马Aβ、APP、BACE1 的表达上调（P ＜0.05），与O 组，S 组比较，Y 组大鼠术后各时点海马Aβ、APP、BACE1的表达下调（P ＜0.05）。C 组与D 组和O 组与S 组大鼠术后各时点海马Aβ、APP、BACE1 的表达比较差异无统计学意义。见表3，图2。

3 讨论

Morris 水迷宫是一种强迫实验动物寻找隐藏在水中平台的一种实验，主要用于测试实验动物对空间位置感和方向感（空间定位）的学习记忆能力［7］。海马是大脑中研究最透彻的结构之一，其一直处于研究记忆神经生物学基础的前沿。随着啮齿类动物海马结构中位置细胞、头部方向细胞和网格细胞的发现，为海马体在记忆形成中发挥关键作用的观点奠定了基础。研究表明，海马CA3区形态学变化可引起学习记忆障碍［8］。本研究结果表明，大鼠脾切除术后逃避潜伏期和游泳路径延长，大鼠海马CA3 区锥体细胞层不完整、排列紊乱、松散，细胞周围出现间隙，其中许多细胞胞体缩小、胞浆呈淡红色、胞核固缩、深染，仅呈很淡的蓝色甚至蓝色消失，提示手术操作后老龄大鼠发生了认知功能障碍，表明老龄大鼠PND 模型制备成功。右美托咪定为选择性α2-肾上腺素能受体激动剂，具有抑制交感神经活性的作用，同时也是治疗疼痛和躁动的一种方法。参照文献［9］及预实验结果，给予50 μg/kg 腹腔注射右美托咪定。

表3 五组大鼠术后各时点海马Aβ、APP、BACE1 表达水平比较Tab.3 Comparison of the expression levels of Aβ、APP、BACE1 at each point between the five groups ±s

表3 五组大鼠术后各时点海马Aβ、APP、BACE1 表达水平比较Tab.3 Comparison of the expression levels of Aβ、APP、BACE1 at each point between the five groups ±s

注：与C 组、D 组比较，*P ＜0.05；与O 组、S 组比较，#P ＜0.05

组别C 组D 组O 组*S 组*Y 组*#Aβ术后1 d 1.01±0.11 1.02±0.09 3.34±0.38 3.41±0.39 2.36±0.22术后3 d 1.01±0.11 1.01±0.09 3.64±0.37 3.32±0.37 2.47±0.23术后7 d 1.01±0.12 1.01±0.09 3.76±0.37 3.29±0.34 2.62±0.24 APP术后1 d 0.93±0.03 0.94±0.04 2.74±0.13 2.67±0.14 1.74±0.09术后3 d 0.94±0.04 0.95±0.03 2.73±0.12 2.76±0.11 1.73±0.08术后7 d 0.95±0.03 0.96±0.04 2.75±0.14 2.76±0.12 1.63±0.07 BACE1术后1 d 0.95±0.09 0.96±0.09 2.96±0.26 2.95±0.27 1.68±0.16术后3 d 0.95±0.09 0.96±0.09 2.98±0.24 2.98±0.29 1.65±0.15术后7 d 0.95±0.09 0.96±0.09 2.91±0.22 2.92±0.27 1.66±0.17

图2 五组大鼠术后各时点海马Aβ、APP、BACE1 的表达水平Fig.2 The expression of Aβ、APP、BACE1 in rat hippocampus at each point between the five groups

长链非编码RNA（lncRNA）最初曾被认为是基因组转录的“噪音”，因其参与了转录激活，转录干扰，核内运输等许多重要的调控过程，近年来引起众多医学研究者的关注［10-11］。BACE1-AS 是一种保守的长约2 kb 的lnc RNA。该基因编码是从另一条链转录到BACE1 的未剪接的长链非编码RNA。编码的转录本被认为与BACE1 mRNA 形成RNA 双工，从而调控其表达，这可能导致Aβ 水平升高和老年斑沉积增加，因此可能在阿尔茨海默病的病理生理学中发挥作用［12］。有研究发现，使用针对lncRNA BACE1-AS 的特异性si RNA 可以降低lncRNA BACE1-AS 的表达水平［13］，这说明lncRNA BACE1-AS 参与了中枢神经退行性病变的发生与发展。因此，本研究选择观察海马lncRNA BACE1-AS 的变化。

本研究结果表明，老龄大鼠术后1、3、5 d 逃避潜伏期和游泳路径延长，海马lncRNA BACE1-AS、BACE1 mRNA、Aβ、APP 及BACE-1 的表达上调，提示手术操作可造成老龄大鼠PND；而给予右美托咪定处理后，老龄大鼠术后1、3、5 d 逃避潜伏期和游泳路径缩短，海马lncRNA BACE1-AS、BACE1mRNA、Aβ、APP 及BACE-1 的表达下调，表明右美托咪定减轻老龄大鼠PND 的机制与抑制lncRNA BACE1-AS 有关。其机制可能是：手术创伤使神经胶质细胞激活，可引起AMPK 的活性升高，从而升高细胞的NAD+合成酶的活性来激活下游SIRT1［14］。一般情况下，细胞浆中的IκB 与NF-κB 复合体结合并抑制NF-κB 的活性，阻止其进入细胞核，但当IκB 磷酸化后，会与NF-κB 分离，这时NF-κB 激活进入细胞核内［15］。活化的NF-κB可使细胞内lncRNA BACE1-AS 活性增加［16］，从而造成lncRNA BACE1-AS 与BACE1mRNA 形成双链结构复合物，避免了BACE1mRNA 被核酸酶降解，增加其稳定性，使得BACE1 蛋白的表达增高。淀粉样前体蛋白集中分布于神经元的突触，BACE1作用生成可溶性的β-APP8 及C99，而C99 又经BACE1 水解产生不溶性的Aβ［17］，从而导致PND。有研究发现，右美托咪定可通过与α2-A 受体结合，阻断AMPK 信号通路［18］。由此推断右美托咪定可通过下调AMPK 活性抑制NF-κB 的活性，使细胞内lncRNA BACE1-AS 活性降低，BACE1mRNA 被核酸酶降解，从而使得APP 和Aβ 表达下降，改善老龄大鼠PND。但右美托咪定是否通过其他机制引起lncRNA BACE1-AS 表达下降还有待进一步研究。