白藜芦醇通过调控mTOR 信号通路抑制结直肠癌细胞的增殖和糖酵解作用

肖忠盛 龙泓 丁成明 肖友忠

南华大学附属第一医院1胃肠外科，2肝胆外科（湖南衡阳421001）

结直肠癌作为最常见的恶性肿瘤之一，已经成为引起成人死亡的第3 大癌症，严重威胁人类生命健康，在美国每年约有14 万人被诊断为结直肠癌，病死率高达36%左右［1］。而在我国，发病率同样逐年递增，结直肠癌发病初期为腺瘤性息肉，进而发展成为腺瘤，最终形成恶性肿瘤，其发生展是一个多阶段、多因素的过程，但其机制仍不完全明了。相比人类和哺乳动物的正常细胞在有氧条件下优先进行有氧氧化供能，癌细胞不论是在有氧还是无氧条件均以糖酵解途径供能，这种独特的能量代谢方式使得癌细胞在缺氧条件下更耐受［2］，因此糖酵解也常常作为衡量抗肿瘤效应的重要指标。该特性与肿瘤细胞的增殖、侵袭密切相关，但其对结直肠癌作用的机制仍未明确，因此了解结直肠癌中糖酵解的调控机制，对防治结直肠癌将具有重要意义。白藜芦醇（resveratrol，Res）最早发现于1939年，广泛存在于葡萄、虎杖、花生、桑椹等植物中［3］。研究表明白藜芦醇在体内或体外对于肺癌、肝癌、乳腺癌等多种癌症具有显著抑制效应，阻碍癌细胞增殖，促进其凋亡［3-4］。同时，mTOR 信号通路作为肿瘤研究中常见信号通路，其过度激活可引起多种癌细胞增殖［5-6］，刘添文等［7］通过下调mir-143 的表达，证明其可以通过调控mTOR 通路促进大肠癌的发生和发展。但白藜芦醇是否可能通过mTOR 信号通路调控结直肠癌的发生发展暂未见有文献报道。本研究探讨白藜芦醇对结直肠癌细胞（LoVo 细胞）增殖及糖酵解的影响，并分析这种作用与mTOR 信号通路的可能关系，为白藜芦醇作为一种单独或联合使用的抗结直肠癌药物提供潜在可能。

1 材料与方法

1.1 实验材料人结直肠癌细胞株LoVo，购自美国模式培养物保藏中心（American TypeCulture Collection，ATCC）。F12K 培养基培（美国Gibco 公司）；白藜芦醇（≥99%）、mTOR 抑制剂Rapamycin（美国Selleck Chemicals 公司）；四甲基偶氮唑蓝（MTT）（美国Sigma 公司）；Cell MeterTM2-NBDG 葡萄糖摄取检测试剂盒（美国AAT Bioquest 公司）；乳酸（LD）检测试剂盒、ATP 含量测定试剂盒均（南京建成生物工程研究所）；己糖激酶（HK）活性检测试剂盒、丙酮酸激酶（PK）活性检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；mTOR、p-mTOR（Ser2448）和GAPDH 抗体均（美国Santacruze 公司）；BCA 蛋白定量检测试剂盒、ECL 检测试剂盒（美国Thermo 公司）

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养人结直肠癌细胞株LoVo 常规培养于含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素双抗溶液的F12K 培养基中，置于37 ℃、5% CO2培养箱，选用对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 MTT 法检测细胞增值将对数生长期的LoVo 细胞悬液调整浓度至1 × 104个/mL 后，接种到96 孔培养板，每孔200 μL，细胞贴壁后，分别加入不同浓度的白藜芦醇（0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2 mmol/L）处理细胞。每个浓度设置6 个复孔，同时设置不加细胞的零孔和不加白藜芦醇的阴性对照孔，分别培养24 h，48 h 和72 h。采用MTT 试剂盒检测不同时间点细胞增殖抑制情况。

1.2.3 平板克隆形成实验取对数生长期的细胞接种于培养皿中，待细胞培养至60% ～70%融合度时，分别采用0.08 mmol/L 白藜芦醇和10 nmol/L Rapamycin 处理48 h，并设置对照组。用0.25% 胰酶消化成单细胞悬液，按1 000 个细胞/孔接种60 mm 细胞培养皿中，于37℃5% CO2培养箱中培养，设置3 个复孔，3 天更换一次培养基，连续培养细胞10 d，实时观察细胞克隆形成情况。

1.2.4 葡萄糖摄取能力及乳酸水平检测取对数生长期的细胞接种于培养皿中，待细胞培养至60% ～70%融合度时，分别采用0.08 mmol/L 白藜芦醇和10 nM Rapamycin 处理48 h，同时设置对照组。细胞培养48 h 后，（1）按照葡萄糖摄取检测试剂盒方法测定不同处理组葡萄糖摄取量；（2）乳酸含量测定：收集细胞培养液上清，采用乳酸含量检测试剂盒测定不同处理后乳酸含量。

1.2.5 细胞ATP 含量检测取对数生长期的细胞接种于培养皿中，待细胞培养至60% ～70%融合度时，分别采用0.08 mmol/L 白藜芦醇和10 nmol/L Rapamycin 处理48 h，同时设置对照组。0.25% 胰酶消化细胞收集于离心管中，10 000 r/min 离心5 min，弃上清，每管加入裂解液100 μL。待细胞充分裂解后，4 ℃，12 000 r/min 离心10 min，收集细胞上清，采用ATP 含量测定试剂盒检测不同处理组ATP 含量。

1.2.6 糖酵解酶关键酶酶活水平测定己糖激酶和丙酮酸激酶活性检测：将对数期的细胞用0.25% 胰酶消化成单细胞悬液，以2 × 105个细胞/孔接种至12 孔板中，贴壁后分别加入0.08 mmol/L 白藜芦醇和10 nmol/L Rapamycin 处理48 h，同时设置对照组，培养48 h 后，收集细胞到离心管内，离心后弃上清；按照500 万细胞加入1 mL提取液，超声波破碎细胞（冰浴，功率20%，超声3 s，间隔10 s，重复5 次）；8 000 g 4℃离心10 min，收集细胞上清，采用己糖激酶及丙酮酸激酶活性检测试剂盒检测不同处理组激酶活性水平。

1.2.7 Western Blot 检测细胞内p-mTOR 和mTOR 蛋白表达对数生长期细胞中加入0.08 mmol/L 白藜芦醇和10 nmol/L mTOR 抑制剂Rapamycin 处理48 h 后，提取蛋白，使用BCA 试剂盒进行蛋白定量；制备PAGE 胶并上样，进行电泳分离，电转法将凝胶上的蛋白转移至PVDF 膜上5%脱脂牛奶室温封闭1 h 分别加入mTOR 抗体（1∶1 000）、p-mTOR 抗体（1∶1000）和GAPDH 抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜；TBST 洗涤3 次，按照1∶10 000 稀释HRP 标记的二抗，37 ℃孵育1 h，TBST 洗涤3 次，ChemiDoc 成像系统（BioRad）进行ECL 曝光成像，分析其灰度值，以GAPDH 作为内参。

1.3 统计学分析实验数据按照均数±标准差表示，采用SPSS 22.0 统计软件进行正态性分析和方差齐性检验，多组间均数比较用单因素方差分析，两组间比较采用t 检验，以P ＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 白藜芦醇对LoVo 细胞增值的影响采用不同浓度的白藜芦醇（0.0125、0.025、0.05、0.1、0.2 mmol/L）分别处理LoVo 细胞24、48 和72 h。MTT实验结果显示，随着白藜芦醇浓度的增加，白藜芦醇对LoVo 细胞增殖抑制率均逐渐上升，均具有一定的时间和剂量依赖性，如表1 所示。白藜芦醇作用于LoVo 细胞24、48、72 h 的半数抑制浓度分别为0.17、0.08、0.05 mmol/L。后续选择0.08 mmol/L白藜芦醇作用48 h 进行实验研究。

表1 白藜芦醇对LoVo 细胞增殖抑制率的影响作用Tab.1 Effect of Res on proliferation inhibition rate of LoVo Cell±s，%

表1 白藜芦醇对LoVo 细胞增殖抑制率的影响作用Tab.1 Effect of Res on proliferation inhibition rate of LoVo Cell±s，%

注：*表示与对照组相比，P ＜0.05

组别对照组白藜芦醇组浓度（mmol/L）0 0.0125 0.025 0.05 0.1 0.2 24 h 1.05±0.12 4.54±1.12*11.74±1.65*25.87±2.73*37.22±5.33*58.73±5.75*48 h 1.35±0.17 8.37±1.24*21.29±3.87*38.77±5.53*48.72±6.93*61.24±5.87*72 h 1.51±0.10 9.91±1.85*28.47±5.62*49.67±6.41*58.78±7.85*69.72±8.29*

2.2 白藜芦醇对LoVo 细胞克隆形成能力的影响平板克隆实验结果显示，对照组、白藜芦醇组和Rapamycin 组细胞克隆形成率分别为（57.23 ±4.23）%、（17.36 ± 1.39）%和（18.67 ± 1.57）%。与对照组比较，白藜芦醇组和Rapamycin 组细胞克隆形成率显著减少（P ＜0.05）；白藜芦醇组与Rapamycin组比较，细胞克隆形成率无显著性差异（P ＞0.05）。见图1。

2.3 白藜芦醇对LoVo 细胞葡萄糖摄取能力及乳酸水平的影响与对照组相比，白藜芦醇和Rapamycin 作用后，LoVo 细胞对葡萄糖的摄取能力均显著下降，差异有统计学意义（P ＜0.5）。同时，与对照组相比，经过白藜芦醇和Rapamycin 处理后，细胞上清中乳酸含量也显著下降，差异有统计学意义（P ＜0.05）。而白藜芦醇组与Rapamycin 组比较，两组间细胞葡萄糖摄取能力和乳酸水平无显著性差异（P＞0.05）。见图2、3。

图1 白藜芦醇对LoVo 细胞克隆形成能力的影响Fig.1 The effect of Res on colony formation of LoVo cells

图2 白藜芦醇对LoVo 细胞葡萄糖摄取水平的影响Fig.2 The effect of Res on Glucose Uptake of LoVo cells

2.4 白藜芦醇对LoVo 细胞中ATP 含量及糖酵解关键酶酶活的影响与对照组相比，LoVo 细胞经白藜芦醇和Rapamycin 处理后，细胞中的ATP 含量显著降低（P＜0.05），而白藜芦醇组与Rapamycin组比较无显著性差异（P＞0.05）如图4 所示。同时，白藜芦醇组与Rapamycin 组细胞中的HK，PK活性也较对照组显著降低（P＜0.05）。见图5。

2.5 白藜芦醇对LoVo 细胞中p-mTOR 和mTOR蛋白表达的影响Western Blot 结果显示，与对照组相比，白藜芦醇组和Rapamycin 组细胞中的总mTOR 蛋白表达水平无显著变化（P ＞0.05），而p-mTOR 水平显著降低（P＜0.05），且白藜芦醇组和Rapamycin 组细胞中mTOR 蛋白和p-mTOR 水平无显著性差异（P＞0.05）。见图6。

图3 白藜芦醇对LoVo 细胞上清乳酸含量的影响Fig.3 The effect of Res on the lactic acid production of LoVo cells supernate

图4 白藜芦醇对LoVo 细胞ATP 生成量的影响Fig.4 The effect of Res on ATP production of LoVo cells

图5 白藜芦醇对LoVo 细胞丙酮酸激酶及己糖激酶活性的影响Fig.5 The effect of Res on activity of HK and PK of the LoVo cells

3 讨论

图6 白藜芦醇对LoVo 细胞mTOR 和p-mTOR 蛋白表达水平的影响Fig.6 The effect of Res on the expression of mTOR and p-mTOR of the LoVo cells

结肠癌是一种临床上常见的恶性肿瘤，其发病率和致死率均较高，尽管目前在针对结肠癌的诊疗上已经取得较大进展，但临床预后情况并不乐观，迫切需要新的治疗方法的出现。白藜芦醇是一种天然的多酚类化合物，主要来源于葡萄、花生、桑葚等植物。本研究采用MTT 和平板克隆实验，发现白藜芦醇能显著抑制人结肠癌细胞LoVo的增殖作用和细胞克隆形成能力。王静宇等［8］发现白藜芦醇对结肠癌细胞HCT116 的增殖具有明显抑制作用，与本研究结果一致，白藜芦醇对结直肠癌具有明显的抗肿瘤作用。

肿瘤的发生、发展离不开能量的供应，而糖酵解途径是肿瘤细胞的主要供能方式，即使是在氧气供应充足的情况下也优先进行糖酵解，而非线粒体的氧化磷酸化，这种异常代谢现象被称为有氧糖酵解即Warburg 效应。HK 作为糖酵解途径中第一个限速酶，在鼻咽癌、乳腺癌等恶性肿瘤细胞中活性较高［9］。PATRA 等［10］发现抑制HK 活性可降低有氧糖酵解水平，使癌细胞代谢方式由有氧糖酵解转变为氧化磷酸化。Warburg 效应的研究中，同样发现抑制PK 能促进有氧氧化取代糖酵解，提高肿瘤放、化疗效果［11］。因此Warburg 效应已经成为肿瘤的特征之一，但其发生机制一直得到不到合理解释，并且多数研究往往只是关注糖酵解途径中的关键酶表达量，而没能整理体认识糖酵解途径的研究机制。本研究不仅完成对Warburg 效应中关键酶的检测，还进行了直接对糖酵解途径中糖代谢和能量代谢的检测，结果表明在白藜芦醇药物干预下，LOVO 细胞中HK、PK 活性显著下调，并且明显减少对葡萄糖的摄取和乳酸、ATP 的生成量，表明白藜芦醇可以改变结直肠癌细胞中糖酵解途径，而达到肿瘤抑制的作用。但HK、PK 等代谢酶除了发挥其本身的代谢功能外，是否在结直肠癌中也具备激酶的活性，有待进一步研究。

mTOR 信号通路的过度活化普遍存在于肿瘤细胞中［12］。mTOR 的活化在肿瘤细胞生长、蛋白质合成、细胞代谢等生理病理过程中发挥重要作用［13］。PARK 等［14］证实白藜芦醇可以通过抑制mTOR 的表达而诱发乳腺癌细胞MCF-7 的自噬作用；王坦也证实白藜芦醇可以抑制人肝癌SMMC-7721 细胞增殖并降低mTOR 蛋白磷酸化水平［15］。本研究中，LoVo 细胞受到白藜芦醇的干预作用后，mTOR 总蛋白的表达量不变，而其磷酸化水平发生显著下调，抑制作用与mTOR 抑制剂一致，与之前研究结果一致，表明白藜芦醇对结直肠癌细胞增殖的抑制剂作用可能是通过mTOR 信号通路实现。而HOU 等［16］能过大鼠动物实验发现，白藜芦醇可以上调mTOR 的表达而影响神经系统的发育，吴印华等也发现白藜芦醇通过激活mTOR/自噬抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导的PC12 细胞损伤及凋亡作用［17］，与本研究结果不一致。白藜芦醇在不同种类的细胞中对mTOR 信号通路的调控作用不同，可能与肿瘤细胞特殊生长发育有一定关系，但具体调控机制，还有待进一步发现。

如今结直肠癌的治疗仍然以手术以术后的放化疗等传统手段为主，术后放化疗产生的毒副作用以及耐药甚至是多重耐药的产生，均会导致患者生存和生活质量的下降。白藜芦醇作为一种低毒高效的植物提取物，其抗肿瘤的作用备受关注，明确其对结直肠癌发生发展的影响及对肿瘤细胞的分子调控机制，将对结直肠癌的诊断和治疗具有重要意义。本研究为白藜芦醇抑制结直肠癌的机制提供了新的思路，也为白藜芦醇作为潜在的结直肠癌治疗手段提供了依据。