青蒿琥酯对结核分枝杆菌诱导的TNF-α、IL-6表达的影响

马小华，刘爱凤，向延根，刘栋宾，潘建华，喻 容，石国民

（长沙市中心医院，1.检验科，2.病理科，湖南 长沙410004）

结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，Mtb）是引起结核病的重要病原菌，是传染性疾病的重要病原体之一［1-2］。Mtb侵入机体，仅有5%～15%的机会发展成活动性肺结核［3］。可见，机体的自我免疫调节对Mtb感染的控制起到至关重要的作用。Mtb诱导机体产生某些前炎细胞因子如TNF-α、IL-6等细胞因子，前者可使炎症反应进一步扩大，进一步加重机体损伤［4］。因此，寻求有效的抗炎制剂，适当的抑制过度的炎症反应有利于维护机体处于稳态。青蒿琥酯（artesunate，ASN）是从菊科植物黄花蒿中分离出的一种能治疗疟疾、具有过氧桥的倍半萜内酯类化合物，为青蒿素的衍生物。体外实验研究发现，青蒿琥酯对结核分枝杆菌具有一定的抑制作用［5］。然而其在机体内如何调节炎症反应尚未清楚。本研究旨在研究ASN对Mtb引起的TNF-α、IL-6表达的影响，并探讨其可能的分子机制。

材料和方法

1 主要试剂和耗材

Mtb临床分离株由本室保存，H37Rv由中国疾病控制中心结核病参比实验室提供，均经100℃30min灭活；THP-1细胞株购于ATCC，由本院中心实验室保存；TNF-α、IL-6试剂盒购于北京四正柏有限公司；所有引物购于金斯瑞公司；超纯RNA提取试剂盒为康为世纪产品；逆转录试剂和SYBR green荧光定量qPCR Mix试剂为GeneCopoeia产品；RPMI1640培养基为Hyclone产品；6、12、96孔板为Corning产品；所有的离心管、枪吸头、八连管等为Axygen产品，均为无热源无内毒素耗材。

2 MTT法检测ASN对细胞毒性影响

MTT法简要操作如下：体外培养THP-1细胞，当细胞生长至融合度约为80%时，换液，用不含血清RPMI1640培养基调整细胞浓度为4×104／mL，取100μL接种于96孔板，加入0～20μg／mL ASN培养12～48 h，然后每孔加入MTT试剂20μL，放置37℃，5%CO2孵育4h，去掉培养基，每孔加入100μL二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），混匀，放置波长为570nm处测量吸光度值。

3 Real-time qPCR检 测TNF-α、IL-6、TLR2mRNA表达

细胞按照实验分组处理完毕后，分别收集24h THP-1细胞，用Trizol试剂盒提取总RNA，引物信息如下：TNF-α上游引物：5′-GCCCAGGCAGTCAGATC ATC-3′，TNF-α下游引物：5′-CGGTTCAGCCACTGGA GCT-3′；IL-6上游引物：5′-TTCGGTCCAGTTGCCTTC TC-3′，IL-6下游引物：5′-GAGGTGAGTGGCTGTCTG TG-3′；TLR2上 游 引 物：5′-CTGCAAGCTGCGGAAG ATAAT-3′，TLR2下游引物：5′-AGGACTTTATCGCAG CTCTCAGA-3′；GADPH上游引物：5′-ACCAGCCTCA AGATCATCAGC A-3′，GADPH下 游 引 物：5′-TGCTAAGCAGTTGGTGGTGC-3′。将提取的总RNA按操作说明做逆转录成cDNA后，进行real-time qPCR。扩增程序如下：95℃10min，然后进行95℃15s，60℃20s，72℃31s共40个循环。所得结果采用2-ΔΔCT方法计算mRNA相对表达量。

4 ELISA检测ASN对Mtb诱导的TNF-α、IL-6分泌影响

按实验设计将细胞分组处理完毕，分别于24 h收集细胞，将细胞通过2个冻融循环（先置-80℃15min，再置37℃15min）充分裂解细胞，将裂解产物置入EP管，1000r／min离心5min，所得上清即为待测样本。按试剂说明行ELISA检测TNF-α、IL-6含量。

5 Western blot检测TLR2受体表达

用无血清培养基调整细胞浓度为1×106个／mL，接种至6孔板，将细胞分组处理完毕，分别于24h收集细胞，预冷的PBS漂洗3次，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液充分裂解细胞后，4℃12000r／min离心10min。取上清用于后续实验。将等量的蛋白上样于12%SDS-PAGE上电泳，转膜，随后置于5%的无脂奶粉中封闭1h，加入不同稀释度的一抗（TLR2：1∶500；β-actin：1∶1000）于4℃孵育过夜，PBST清洗3遍，加入1∶5000二抗，37℃孵育1 h，ECL试剂显影。

6 统计学处理

结 果

1 青蒿琥酯对细胞毒性研究

为了研究青蒿琥酯（ASN）对THP-1细胞的活性的影响，本研究采用0～20μg／mL的ASN对THP-1细胞进行处理，MTT法检测THP-1细胞活性。图1显示，上述ASN浓度下THP-1细胞活性均大于90%以上，说明上述浓度ASN对THP-1细胞活性并不产生毒性，可用于后续研究。

图1 ASN对细胞毒性影响

2 青蒿琥酯对Mtb诱导的TNF-α表达影响

Mtb诱导的TNF-α过量表达能进一步加重组织损伤，为了研究ASN能否减弱Mtb诱导的炎症反应，本研究采用5～20μg／mL ASN预处理THP-1细胞4h，随后加入Mtb（MOI为10∶1）进行刺激THP-1细胞24 h，RT-qPCR检测TNF-αmRNA表达，ELISA测定TNF-α蛋白分泌。图2结果显示，ASN能浓度依赖性地抑制TNF-αmRNA和蛋白表达，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

图2 ASN对Mtb诱导的TNF-α表达影响

3 青蒿琥酯对Mtb诱导的IL-6表达影响

为了研究ASN能否减弱Mtb诱导的IL-6表达，本研究采用20μg／mL ASN预处理THP-1细胞4 h，随后加入Mtb（MOI为10∶1）进行刺激THP-1细胞24 h，RT-qPCR、ELISA分别检测IL-6 mRNA和蛋白分泌。图3结果显示，ASN能抑制IL-6 mRNA和蛋白表达，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图3 ASN对Mtb诱导的IL-6表达影响

4 青蒿琥酯对Mtb诱导的TLR2表达影响

为了研究ASN能否减弱Mtb诱导的TLR2受体表达，本研究采用20μg／mL ASN预处理THP-1细胞4h，随后加入Mtb（MOI为10：1）进行刺激THP-1细胞24h，RT-qPCR、Western blot分别检 测TLR2 mRNA及蛋白表达。图4结果显示，ASN能抑制TLR2 mRNA和蛋白表达，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图4 ASN对Mtb诱导的TLR2表达影响

讨 论

结核病是危害人类健康的主要传染病之一。据2017年WHO报告的全球结核病现状显示，2016年全球新发结核病为1040万人，其中MDR-TB和RRTB新发病例数达60万［6］。由于抗结核新药的匮乏，给这些新发病的耐药患者的治疗带来了困扰，包括治疗效果差，不良反应大，治愈率低。因此，寻找有效的抗结核新药迫在眉睫。青蒿琥酯是从菊科植物黄花蒿中分离出的一种能治疗疟疾、具有过氧桥的倍半萜内酯类化合物，为青蒿素的衍生物。我们前期研究已经发现青蒿琥脂能有效地逆转MTB对抗结核药物的耐药性［7］。本研究中，我们探讨了ASN对MTB诱导的炎症的影响并探讨可能机制。结果显示，ASN能显著降低MTB诱导的TNF-α和IL-6分泌（P＜0.05），可能与ASN降低TLR2受体表达有关。

当机体受到MTB感染后，TNF-α是出现时间最早的促炎细胞因子，表达变化最明显。TNF-α能激活中性粒细胞，促使中性粒细胞粘附于细胞内皮细胞，进而游离出血管进入炎症部位，大量的中性粒细胞聚集并激活可导致氧自由基和蛋白水解酶等释放，同时能刺激单核细胞和中性粒细胞释放IL-6、IL-1β和其本身释放，机体在清除病原体的过程中也会引起严重的组织损伤甚至休克，加重肺组织损伤［8］。因此，在MTB引起的持续性感染的过程中，有必要抑制过量的细胞因子的分泌以缓解由其引起的过度的炎症反应。本研究发现ASN显著抑制TNF-α、IL-6mRNA及蛋白分泌，说明ASN可能具有缓解Mtb引起的炎症反应作用。

TLRs受体是一种具有保守结构的单个跨膜非催化蛋白分子，表达于免疫细胞表面重要的PRRs，是连接天然免疫和特异性免疫的桥梁［9-10］。目前发现并命名的TLRs受体中有11种表达于人类。TLRs是免疫细胞抵抗病原菌感染的重要受体［11］。在感染期间，TLRs与病原体配体结合，随后通过MyD88依赖性途径或非依赖性途径介导的信号传导途径调节细胞因子分泌［12］。文献报道TLR2和NOD2能介导金黄色葡萄球菌感染释放细胞因子，而ASN能通过抑制TLR2和NOD2表达进而减少细胞因子分泌［13］。李斌等［14］报道ASN能抑制LPS或热休克大肠埃希菌等诱导的TLR4mRNA的表达，进而抑制前炎细胞因子产生。本研究发现ASN能够抑制Mtb诱导的TLR2mRNA和蛋白表达。推测ASN可能通过抑制TLR2受体而抑制TNF-α和IL-6的分泌。

综上所述，ASN能够抑制Mtb诱导的TNF-α和IL-6分泌，并且能够抑制Mtb诱导的TLR2 mRNA和蛋白表达。因此，在Mtb引起的持续性感染的过程中，ASN可能具有缓解Mtb诱导的炎症反应作用，可能成为一种潜在的抗结核的免疫制剂。