灵芝、杏鲍菇混合发酵牛蒡白果茶饮料的研制

王凡，葛蒙蒙，高忠辉，王振宇，苗敬芝, *，董玉玮,

1. 徐州工程学院食品工程学院（徐州 221018）；2. 徐州工程学院江苏省食品资源开发与质量安全重点建设实验室（徐州 221018）

灵芝是一种营养价值和药用价值极高且无毒副作用的药食同源真菌[1]，具有扶正固本、滋补强壮的功效，灵芝的主要有效成分有灵芝多糖、三萜类、多肽、生物碱和有机锗等，具有提高机体免疫力、降血糖血脂、抗肿瘤和延缓衰老等功效[2]。

杏鲍菇是一种药食两用的食用菌，杏鲍菇具有降血脂、降胆固醇和促消化等食疗效果，杏鲍菇中所含的真菌多糖含有很多的生物活性，能清除自由基、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤等作用[3]。

牛蒡属菊科牛蒡属，为药食同源植物，牛蒡中含有菊糖、蛋白质、氨基酸、生物碱、钙、磷和铁等人体所需要的营养物质，具有清除体内毒素、改善体循环、治疗糖尿病、预防肥胖和便秘等效果明显[4-5]。

白果中含有银杏内酯、氨基酸和银杏黄酮等活性成分，具有抗衰老、抗肿瘤和降血糖等功效，同时还具有抑菌作用，对葡萄球菌、链球菌、炭疽杆菌和伤寒杆菌等具有不同程度的抑菌作用[6-7]。

绿茶是采取茶树上鲜嫩的叶和芽，经去青、炒制、烘干，不用发酵，更好地保留了新鲜茶叶的自然成分，绿茶的主要成分有茶多酚、儿茶素、咖啡碱、氨基酸和维生素等，具有防癌、抗癌、清心和提神等功效[8-9]。

随着人们生活水平的提高，消费者对饮料的嗜好和需求发生了巨大变化，向着营养、功能、安全方向发展。目前对灵芝、杏鲍菇的营养保健作用已得到普遍认同，若能将灵芝、杏鲍菇二者放在同一反应体系中进行发酵，研制成新型保健饮料，则营养、功效更为全面，口感更佳，符合消费者对健康的需要，顺应灵芝、杏鲍菇深加工的发展趋势。

试验采用混合发酵技术[10]，选取药食同源灵芝、杏鲍菇混合发酵，以牛蒡为培养基质，发酵液与菌丝体经预处理，与白果汁、菊花汁和绿茶汁等制成凉茶饮料，满足消费者对保健凉茶饮料的需求，具有良好的发展前景。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

灵芝、杏鲍菇菌种（北京吉蕈园科技有限公司）；白果、牛蒡、土豆、绿茶和蜂蜜等原材料（市场购买）。

酵母浸膏；β-环状糊精、海藻酸钠、硫酸、苯酚、香草醛、高氯酸等试剂（均为分析纯）。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2 FD超净工作台（上海博讯实业有限公司医疗设配厂）；HH.B 11.600-S-Ⅱ恒温培养箱（上海跃进医疗机械厂）；HZ 150 L恒温培养摇床（武汉瑞华仪器设备有限责任公司）；DL-5低速大容量离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；IXQSG 46-280 A立式压力蒸汽灭菌机（上海申安医疗机械厂）。

1.3 方法

1.3.1 灵芝、杏鲍菇菌种的活化与培养

配制马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基：按照GB 4789.15—2010配制，用于菌种的复苏与保存。

制备牛蒡液体培养基：取一定量新鲜去皮牛蒡根，加一定量水，用组织捣碎机破碎，加入定量酵母浸膏混匀，于电炉上煮沸并且保持沸腾几分钟。

灵芝、杏鲍菇单菌发酵培养：取灵芝和杏鲍菇菌株分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上活化，取活化后灵芝菌块接种于27 ℃牛蒡液体培养基中，在110 r/min恒温摇床上培养7 d，取活化后杏鲍菇菌块接种于25 ℃牛蒡液体培养基中，120 r/min恒温摇床上培养5 d。

灵芝、杏鲍菇混合发酵培养：分别取灵芝、杏鲍菇单菌种子液5 mL接种于25 ℃牛蒡液体培养基中，在120 r/min恒温摇床上培养5 d，用苯酚-硫酸法测胞外多糖含量。

1.3.2 白果汁、绿茶汁的制备

1.3.2.1 白果汁的制备

将白果外壳和内皮脱去，果肉放在水中进行浸泡24 h，在沸水中进行预煮10 min，和水按1:10的质量比放在织捣碎机破碎，加入NaHCO3调节pH至6.2，加入0.12%的木瓜蛋白酶，搅拌均匀，50 ℃酶解1.5 h，90 ℃水浴锅中灭酶10 min；冷却至室温后调节pH至4.0，加入0.08%的α-淀粉酶，搅拌均匀，55 ℃酶解2 h之后取出灭酶，冷却后再调节pH至7.0；真空抽滤得到白果汁[11]。

1.3.2.2 绿茶汁的制备

将绿茶放入一定量的烧杯中，按1:50的质量比加入绿茶和蒸馏水，于90 ℃水浴锅中浸泡10 min，冷却、过滤得到绿茶汁。

1.3.3 灵芝、杏鲍菇混合发酵培养单因素试验

分别改变培养时间（4，5，6，7和8 d），液体培养基牛蒡配比（8%，10%，12%，14%和16%），液体培养基酵母浸膏配比（0.8%，1.0%，1.2%，1.4%和1.6%），考察各因素对灵芝、杏鲍菇混合发酵胞外多糖的影响。

1.3.4 复合保健饮料工艺流程[12-13]

灵芝、杏鲍菇菌种活化→灵芝、杏鲍菇单菌液体发酵培养→灵芝、杏鲍菇混合液体发酵培养→发酵液离心、过滤→滤液作为调配液，添加白果汁、菊花汁、绿茶汁、稳定剂、柠檬酸、蔗糖、蜂蜜等调配→均质→灌装→封口→灭菌→冷却→成品

1.3.5 复合保健茶饮料调配单因素试验

分别改变发酵液（5%，10%，15%，20%和25%），白果汁（5%，10%，15%，20%和25%），蔗糖（4%，5%，6%，7%和8%），绿茶汁（4%，10%，16%，22%和28%）的混合比例，考察各因素对茶饮料感官品质的影响。

1.3.6 保健饮料调配的正交试验设计

以感官评分为指标，选择发酵液、白果汁、蔗糖和绿茶汁作为影响因素进行四因素三水平的正交试验，因素水平见表1。

1.3.7 保健饮料品质检测

1.3.7.1 感官评价

选择10名专业人员对复合茶饮料进行感官评分[14]，评分标准见2。

表2 茶饮料感官评分标准

1.3.7.2 理化指标测定方法

多糖采用苯酚-硫酸法测定，三萜类化合物采用可见分光光度法测定[15]，总酸度采用酸碱滴定法，可溶性固形物采用折光法测定。

铅采用GB 5009.12—2017《食品安全国家标准 食品中铅的测定》测定，砷采用GB 5009.11—2014《食品安全国家标准 食品中总砷及无机砷的测定》测定。

1.3.7.3 微生物指标测定方法

菌落总数采用GB 4789.2—2016方法测定，大肠菌群采用GB 4789.3—2016方法检测。

2 结果与分析

2.1 灵芝、杏鲍菇混合培养条件的选择

2.1.1 培养时间对胞外多糖含量的影响

从图1中可以看出，发酵液中的胞外多糖含量是随培养时间增加而不断提高，培养时间在第7天时，胞外多糖含量达到最大值，为18.35 mg/mL，第8天开始下降，可能是培养基中的营养物质因消耗而降低。

图1 培养时间对胞外多糖含量的影响

2.1.2 培养基牛蒡配比对胞外多糖含量的影响

从图2可知，随着培养基中牛蒡量的增加胞外多糖先增加后降低，牛蒡配比10%时，发酵液中多糖含量达到最大值，为17.48 mg/mL。

图2 培养基牛蒡配比对胞外多糖含量的影响

2.1.3 培养基酵母浸膏配比对胞外多糖含量的影响

从图3中可知，随着培养基中酵母浸膏的增加胞外多糖先增加后降低，酵母浸膏配比1.0%时，发酵液中胞外多糖含量达到最大值，为17.17 mg/mL。

图3 培养基酵母浸膏配比对胞外多糖含量的影响

2.2 保健茶饮料调配单因素试验条件选择

2.2.1 发酵液添加量对感官评价的影响

根据图4可知，发酵液比例10%时，感官评价分达到最大值，为90分。发酵液比例超过10%时，感官评分值下降，原因可能是发酵液过多时，过浓的发酵液味导致饮料口感评分下降，下咽时有灵芝的苦味。因此，选择发酵液比例5%，10%和15%为正交试验的水平。

图4 发酵液添加量对感官评价的影响

2.2.2 白果汁添加量对感官评价的影响

根据图5可知，白果汁比例10%时，感官评价分达到最大值，为91分。白果汁比例超过10%时，感官评分下降，可能是因为白果汁过浓影响了饮料的口感。因此，选择白果汁比例5%，10%和15%为正交试验的水平。

图5 白果汁添加量对感官评价的影响

2.2.3 蔗糖添加量对感官评价的影响

根据图6可知，随着蔗糖添加量的增加感官评分先增加后降低，蔗糖比例6%时，感官评价分达到最大值，为92分，酸甜适宜。因此，选择蔗糖比例5%，6%和7%为正交试验的水平。

图6 蔗糖添加量对感官评价的影响

2.2.4 绿茶汁添加量对感官评价的影响

根据图7，随着绿茶汁添加量增加，感官评分值也逐渐增大，添加量16%时，感官评价分达到最大值，为92分，比例超过16%时，感官评分值下降。绿茶汁过浓时，绿茶味过重，导致饮料的口感下降。因此，选择绿茶比例10%，16%和22%为正交试验的水平。

图7 绿茶汁添加量对感官评价的影响

2.3 复合保健茶饮料调配正交试验

保健饮料口感调配优化正交试验，结果见表3。

复合保健茶饮料最优调配方案为A3B2C3D2，即发酵液15%、白果汁10%、蔗糖7%、绿茶16%，根据极差分析，各因素对饮料感官影响程度的主次顺序是A＞D＞B＞C，即发酵液＞绿茶汁＞白果汁＞蔗糖。按最优方案调配复合茶饮料，进行感官评定，感官综合评价为94分。复合茶饮料呈浅黄色，酸甜适中，具有灵芝、杏鲍菇、白果汁、牛蒡和菊花特有的复合香气与滋味，营养丰富、功效齐全。

表3 保健茶饮料调配正交试验结果

2.4 饮料品质检测结果

2.4.1 感官指标检测结果

色泽：呈淡黄色，均匀一致。香气和滋味：既有灵芝和杏鲍菇独特风味，又有白果、菊花、绿茶香气和滋味，风味纯正。组织状态：透明澄清，久置无沉淀。口感：甘苦适宜，口感较好，下咽时留有余香。

2.4.2 理化指标检测结果

多糖含量6.94 mg/mL，三萜类化合物含量0.041 3 mg/mL，总酸含量0.523 g/100 mL，茶多酚含量363.46 mg/kg，可溶性固形物含量10.30%；铅含量0.023 mg/L，砷含量0.050 mg/L，铅和砷含量符合国家标准。

2.4.3 微生物指标检测结果

菌落总数为2.20×104CFU/mL，未检出大肠杆菌，符合国家卫生标准。

3 结论

灵芝、杏鲍菇混合发酵最佳培养条件为：培养时间7 d、液体培养基牛蒡配比10%、液体培养基酵母浸膏配比1.0%时，混合发酵液中胞外多糖含量最高。

通过单因素和正交试验优化复合保健茶饮料调配条件，最佳配方为：发酵液15%、白果汁10%、蔗糖7%、绿茶16%。经均质、罐装、灭菌、冷却得到成品。产品透明澄清，呈淡黄色，既有灵芝和杏鲍菇独特风味，又有白果、菊花、绿茶复合香气与滋味，风味纯正，酸甜适宜，口感好，营养齐全，符合国家卫生标准。