超声波辅助碱提香菇柄中水溶性蛋白的工艺

冯拓，李超*，单培，彭成海，吴亚飞，张茜

徐州工程学院食品工程学院（徐州 221018）

香菇加工的下脚料——香菇柄，约占香菇总质量的30%，其中蛋白质约19%，可溶性多糖4%，纤维素65%和脂肪2.6%。从数据可以看出，香菇柄中含有丰富的蛋白质，与蛋白含量较高的牛肉、鸡肉等相比，香菇柄是一种很好的植物性蛋白来源。但是，由于香菇柄纤维化程度高、适口性差，往往被制成动物饲料或肥料甚至被当作废弃物料，造成环境污染和资源浪费[1]。目前，传统的蛋白质提取方法主要是碱溶酸沉法，提取率低、提取时间长，且容易造成活性物质结构和性质等发生改变；而超声波辅助提取则利用机械效应对原料有很强的破坏作用，可使细胞组织变形；利用空化效应，介质内部气泡形成共振腔，共振腔的闭合产生微激波，可造成植物细胞壁及整个生物体的破裂，增加溶质穿透力；利用热效应增大药物有效成分的溶解速度，从而提高提取率，缩短提取时间[2-4]。针对香菇柄的现状，以蛋白质得率为指标，通过单因素和响应面试验，研究超声波辅助碱液提取香菇柄中水溶性蛋白的影响，优化其提取工艺，以期为香菇柄水溶性蛋白的进一步深加工提供原料来源，对促进香菇资源的深度开发，延伸产业链，减少环境污染具有一定意义。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

香菇柄（河南菇太郎食品有限公司）；无水乙醇（天津市大茂化学试剂厂）；浓盐酸（上海凌峰化学试剂有限公司）；磷酸（西陇化工股份有限公司）；氢氧化钠（徐州市科翔化学试剂有限责任公司）；考马斯亮蓝G250（国药集团化学试剂有限公司）；牛血清白蛋白（南京奥多福尼生物科技有限公司）。

1.2 仪器与设备

DFY-1000型摇摆式高速万能粉碎机（温岭市林大机械有限公司）；XMT-152电热恒温干燥箱（上海跃进医疗器械厂）；HH-4型数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）；飞鸽牌TDL-80-2B型离心机（上海安亭科学仪器厂）；SHB-ⅢS循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；FA-2004型电子天平（上海越平仪器有限公司）；PHS-3C数显台式酸度计（上海浦春计量仪器有限公司）；KBS-250型数控超声波细胞粉碎机（昆山市超声仪器有限公司）；723C型可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

香菇柄烘干→粉碎→用60目筛过筛→称取3 g脱脂原料→加一定pH的提取剂（氢氧化钠溶液）→超声波辅助提取→离心（4 000 r/min，15 min）→上清液→抽滤→定容→测定蛋白质含量。

1.3.2 工艺优化设计

分别以液料比值、pH、超声功率、超声温度和超声时间为影响因素考察其对得率的影响；根据Box-Behnken试验设计原理，选取影响显著的因素进行响应曲面设计与分析，因素水平表见表1。共17个试验点，其中12个为析因点，5个为中心点。

表1 因素水平表

设该模型通过最小二乘法拟合的二次多项方程：EY=β0+β1x1+β2x2+β3x3+β12x1x2+β13x1x3+β23x2x3+β11x12+β22x22+β33x32+ε。其中，EY，得率%；β0，常数项；β1，β2和β3，线性系数；β12，β13和β23，交互项系数；β11，β22和β33，二次项系数；x1，x2和x3，自变量代码值；ε为随机误差。

1.3.3 提取液中蛋白含量测定

考马斯亮蓝法[5-8]。

1.3.4 得率的计算

式中：m0为香菇柄粉的质量，g；m1为提取液中蛋白质的质量，g。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 液料比的确定

固定pH 10、超声功率50 W、超声温度40 ℃和超声时间36 min，以液料比值为考察因素，结果如图1。液料比值小于16 mL/g时，随着液料比增加，得率随之增加；液料比值为16 mL/g时达到峰值，这是因为随着加入溶剂量增大，溶剂和香菇柄粉末之间的接触面变大，从而有利于促进水溶性蛋白的溶出；液料比值大于16 mL/g时，得率不再进一步增加，反而在不断降低，这是因为过高的液料比会大大降低超声能量在提取液中的分布密度，从而影响水溶性蛋白的溶出。因此，最适提取液料比值为16 mL/g。

2.1.2 pH的确定

固定液料比值16 mL/g、超声功率50 W、超声温度40 ℃和超声时间36 min，以pH为考察因素，结果如图2。随着pH增大，得率也逐渐升高，这是因为pH影响蛋白质之间，以及蛋白质与溶剂间的相互作用，从而影响蛋白质溶解性。考虑到pH超过11时，碱性条件下易导致蛋白质水解甚至氨基酸结构的改变，影响蛋白质的营养价值及功能性质[9]。同时，过强的碱性环境，会改变蛋白质的营养学特性，生成赖氨酰丙氨酸，引起营养物质的损失[10-11]；除此之外，高碱条件下还会使蛋白质变性和水解；加速美拉德反应，产生黑褐色物质；使提取物中非蛋白质含量增加，分离效果降低[11-12]。因此，最适提取pH为11。

图1 液料比值的影响

图2 pH的影响

2.1.3 超声功率的确定

固定液料比值16 mL/g、pH 11、超声温度40 ℃和超声时间36 min，以超声功率为考察因素，结果如图3。超声功率0～100 W时，随着超声功率增大，超声波对细胞壁的破碎作用增强，细胞内蛋白质溶出速率增加，得率也逐渐提高；超声功率100～250 W时，随着超声功率增大，得率逐渐下降，主要原因是超声功率大于100 W时，超声作用进一步增强，加速提取液流动，从而使物料停留在超声场中的时间缩短，破壁作用随之减弱，蛋白质溶出速率减缓，也可能是功率过大引起部分蛋白质的降解。而且对于特定的物质，超声作用的效果取决于超声功率和提取物的结构与性质，不同的提取物适宜不同的提取超声功率[13]。因此，最适超声功率为100 W。

2.1.4 超声温度的确定

固定液料比值16 mL/g、pH 11、超声功率100 W和超声时间36 min，以超声温度为考察因素，结果如图4。在试验温度范围内，得率先随着超声温度的增加而增大，在50 ℃时达到最大，之后随温度上升得率反而下降。温度升高，分子之间热运动加剧，促使提取过程中传质速率上升，提取速率加快。在温度相对较低的情况下，超声空化作用能促使香菇柄组织中水溶性蛋白最大限度溶出。另一方面，提取时蒸汽压随温度的升高而上升，导致空化强度或空化效应下降，从而不利于提取过程的强化，故温度超过某一限度后，提取率反而下降[14-15]。因此，最适超声温度为50 ℃。

图3 超声功率的影响

图4 超声温度的影响

2.1.5 超声时间的确定

固定液料比值16 mL/g、pH 11、超声功率100 W和超声温度50 ℃，以超声时间为考察因素，结果如图5。随着时间延长，得率先显著增加，这主要是因为随着超声时间的延长，超声波对底物产生的搅拌及空化作用增强，进而导致与淀粉结合紧密的蛋白从淀粉蛋白络合物中分离出来。超声处理时间36 min时，得率达到最大；之后随超声处理时间的进一步延长，上清液中蛋白的得率略有下降，这可能是由于超声提取时间过长，超声波引起蛋白结构变化，使蛋白发生变性[16]。因此，最适提取时间为36 min。

图5 超声时间的影响

2.2 Box-Behnken试验

2.2.1 模型建立及其显著性检验

运用Design Expert V 7.0.0软件对表2中得率进行拟合，得回归方程：得率=-6.074+0.45x1+5.75×10-2x2+0.16x3+5×10-4x1x2-6.77×10-4x1x3-2.08×10-4x2x3-1.30×-6.12×-1.55×。

表2 Box-Behnken试验结果

对此回归方程进行方差分析并绘制响应图和等高线，方差分析表见表3。

由表3可知，模型对应的p＜0.01和失拟项对应的p＞0.05，说明模型是可靠的；=0.906 8，说明得率的变化有90.68%来源于液料比值、超声温度和超声时间；S/N=12.12（＞4），也从另一个方面说明该模型是可靠的。同时由表3中p值可知蛋白质得率影响大小的因素主次顺序为：液料比值＞提取时间＞提取温度。

表3 方差分析结果

2.2.2 响应曲面分析

响应图和等高线见图6。等高线越偏向椭圆形，说明交互作用越强；反之越偏向圆形，交互作用越弱；同时有闭合的椭圆形或圆形，也说明在所研究的范围内有最值。由图6（a）可知，固定超声时间为48 min时，分别随着液料比值和超声温度的增大，得率均呈先增加后降低趋势，液料比值在16.2～17.2 mL/g的范围内，超声温度在43～48 ℃的范围内较适合；等高线呈闭合的圆形和响应面呈凸形，说明液料比值和超声温度交互作用较弱且有最大值；由图6（b）可知，固定超声温度为50 ℃时，分别随着液料比值和超声时间的增大，得率均呈先增加后降低趋势，液料比值在16.3～17.3 mL/g的范围内，超声时间在44.5～47.5 min的范围内较适合；等高线呈闭合的圆形和响应面呈凸形，说明液料比值和超声时间交互作用较弱且有最大值；由图6（c）可知，固定液料比值为16 mL/g时，分别随着超声温度和超声时间的增大，得率均呈先增加后降低趋势，超声温度在42.5～48.5 ℃的范围内，超声时间在44.5～48.5 min的范围内较适合；等高线呈闭合的圆形和响应面呈凸形，说明超声温度和超声时间交互作用较弱且有最大值。试验分析和表3中p值显示的显著性一致。

图6 响应图和等高线

2.2.3 最佳参数确定

运用JMP V 7.0软件对所得的回归方程进行逐步回归，并且考虑到实际情况，获得最佳制作工艺参数为：液料比值16.8 mL/g、超声温度45.3 ℃和超声时间46.4 min。此时得率2.84%。进行3次验证，实际得率2.87%。

3 结论

在单因素试验基础上，运用响应面分析法对提取香菇柄中水溶性蛋白的提取条件进行优化，得蛋白质得率影响大小的因素主次顺序为：液料比值＞提取时间＞提取温度。其最佳工艺参数为：液料比值16.8 mL/g、超声时间46.4 min、超声温度45.3 ℃。此时蛋白质实际得率为2.87%。研究为香菇加工的下脚料——香菇柄的有效利用和香菇产业的产品多样化提供了理论依据。