NET-1在结肠癌中的表达、临床意义和预后分析

杨永江，武雪亮，屈 明，李曙光，薛 军

据最新流行病学调查显示，2014年我国居民结直肠癌发病例数继肺癌、胃癌之后位居第三，死亡例数继肺癌、肝癌、胃癌、食管癌之后位居第五，严重威胁国民健康安全。在经济发展迅速的今天，该病在我国的发病率反而呈上升趋势，并且近来有年轻化的趋势[1-2]。新四极体-1(new EST tetraspan numbered 1,NET-1)是近年来发现的一种致癌基因，与肿瘤细胞的增殖、浸润、迁移和转移密切相关。研究[3-5]证实，NET-1在子宫内膜癌、肺癌、胃癌等诸多恶性肿瘤中均呈高表达状态，而在结肠癌中的相关研究尚未见报道。该研究应用RT-PCR、Western blot、免疫组化法(immuno-histochemical staining，SP)，从基因、蛋白水平分析NET-1在结肠癌组织中的表达情况及与相关临床病理特征的关系，为结肠癌的早期诊断、治疗和预后监测提供可靠的分子生物学指标。

1 材料与方法

1.1 病例资料收集2012年1月～2013年10月河北北方学院附属第一医院胃肠肿瘤外科手术切除的原发性结肠癌和癌旁正常组织标本各50例，材料来自于病理标本被证实的癌灶中心的癌细胞组织，另取标本残端切缘经病理证实为正常结肠组织，所有病例均为原发肿瘤，且术前未行新辅助放化疗等治疗。

1.2 主要试剂与实验方法

1.2.1主要试剂 兔抗人浓缩型NET-1单克隆抗体、免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒购自北京中杉公司，RM-2245组织切片机购自德国LEICA公司，Odyssey双色红外荧光成像仪购自德国LI-COR公司。TRIzol裂解液购自南京KeyGentrans公司，DEPC水购自美国sima公司，RNA逆转录试剂盒购自加拿大Fermentas，引物及产物测序购自长沙达尔锋生物科技有限公司， 荧光定量PCR仪购自郑州南北仪器设备有限公司。

1.2.2RT-PCR法 提取总RNA浓度，设计NET-1上游引物：5′-CTCTCCAGCCCAGTCTCACA-3′下游引物：5′-CCCTCACACTCTTCGTGCAG-3′；Beta-Actin上游引物：5′-GTCCACCTTCCAGCAGATGT-3′，下游引物：5′-CTGTCACCTTCACCGTTCCA-3′；反应体系：1×PCR Buffer 2.5 μl，dNTP 0.5 μl，cDNA模板2 μl，Taq酶1.25 U，上下游引物各1 μl，RNA 酶抑制剂1 μl，反应总体积25 μl。扩增条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40个循环。2%琼脂糖凝胶后电泳分离，紫外线灯下观察。

1.2.3Western blot法 提取50 mg蛋白，置入5×缓冲液(4 ∶1)，电泳，转至PVDF膜，加5%脱脂奶粉封闭，滴加特异性的一抗，-4 ℃孵育过夜，加TBST洗涤液，滴加特异性二抗，37 ℃孵育1 h，再次加入TBST洗涤液，荧光成像检测定量分析，计算目的蛋白相对表达量。

1.2.4SP法 10%的甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片厚度4 μm，苏木精-伊红染色，病理诊断。80 ℃烤箱烘烤30 min，脱水，内源性过氧化物酶灭活，高温高压水化修复；加入一抗(1 ∶100)50 μl，4 ℃一夜；加入二抗50 μl，DAB显色，苏木精轻度复染，盐酸乙醇分化，梯度乙醇脱水(70%～90%～100%)，松节油透明和树胶行封片处理，PBS代替一抗作为阴性对照，光镜下观察。

1.2.5结果判定 按染色强度：无着色为0分，淡黄为1分，深黄2分，棕褐或棕黄3分；阳性细胞计数：<10%为0分，10%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为 4分。两者相加<2分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～5分为中等强度阳性()，6～7分为强阳性()，由两名具备高级职称的病理医师经双盲法独立评分。

1.2.6随访 定期复查、电话随访，末次随访时间为2017年12月31日，中位随访时间为50个月。

2 结果

2.1 RT-PCR检测NET-1mRNA的表达以NET-1/Beta-Actin比值作为RT-PCR定量分析，癌组织中NET-1mRNA的表达水平(0.95±0.07)，结直肠正常组织为(0.26±0.04)，差异有统计学意义(t=3.890，P=0.005)，见图1。

2.2 Western blot检测NET-1蛋白的表达以NET-1/Beta-Actin比值作为NET-1相对表达量，癌组织和正常组织中NET-1蛋白的表达水平差异有统计学意义(t=4.010，P=0.003)，见图2。

图1 RT-RCR检测NET-1在癌和癌旁正常组织中的表达

图2 Western blot检测NET-1在癌和癌旁正常组织中的表达

2.3 SP检测NET-1蛋白的表达结肠癌组织中NET-1的阳性表达率为64.00%(32/50)明显高于在正常组织中的表达36.00%(18/50)，差异有统计学意义(χ2=9.392，P<0.001)，见图3。

2.4 NET-1表达与临床病理参数的关系NET-1的表达与肿瘤的TNM分期、淋巴结转移、肝转移、脉管浸润等相关，P均<0.05。分期越高、伴淋巴结转移、肝转移和脉管浸润的患者NET-1的表达均明显增强，见表1。

表1 结肠癌组织中NET-1的表达与临床病理参数的关系

图3 癌旁正常组织和癌组织中NET-1的表达 SP×100

2.5 生存分析NET-1阳性组的中位生存时间为299 d(95%CI：230.07～303.93)，阴性组的中位生存时间为387 d(95%CI：279.16～335.82)，差异有统计学意义(P=0.031)，生存曲线如图4。

2.6 Cox回归分析Cox回归模型分析显示，NET-1表达水平(P=0.002)、脉管浸润(P=0.001)、是否存在转移(P<0.001)和TNM分期(P<0.001)均是影响结肠癌患者预后的独立因素，见表2。

表2 结肠癌患者预后Cox多因素回归分析

3 讨论

NET-1基因是研究较热的一种致癌基因，系四聚体超家族(tetramer superfamily,TM4SF)的成员之一。NET-1基因定位于人染色体1p34.1，其mRNA全长为1 297 bp，编码蛋白质序列长为128～853 bp，内含241个氨基酸的开放阅读框，具有典型的TM4SF结构特征[6]。NET-1基因表达广泛，几乎表达于人类所有组织及相应肿瘤细胞，通过与跨膜结构区域的半胱氨酸残基特异性结合，从而介导信号向胞外转导，参与肿瘤发生、进展的各个环节[7]。

图4 结肠癌患者NET-1表达水平与生存期相关性

NET-1的发现主要是在基因芯片技术发展的基础上开始被揭示的，随着基因芯片技术的发展，在之后的研究中发现，NET-1、复制因子C亚单位2等因子在鼻咽癌组织中检测到相对于正常组织中较高的表达水平，差异明显。并且在重复测量后也得到相同的结果，提示NET-1的表达可作为鼻咽癌发生、发展的生物学标志物[8-9]。进一步研究发现该基因的表达水平与皮肤鳞癌的病理分型之间存在关联，在一级和三级中的表达存在明显差异，因而证实NET-1的表达水平与皮肤鳞癌的恶性程度、浸润和侵袭能力呈一定正相关[10]。

目前，对于NET-1在肝细胞癌和子宫内膜癌中的研究较多，Wang et al[11]研究证实NET-l通过激活细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)使p27蛋白发生泛素化、磷酸化、降解，从而导致细胞周期调控紊乱，同时将多种细胞外信号逐级传递至细胞核，促进细胞增殖和浸润。Wu et al[12]在镜下发现NET-1在弥漫浸润的癌细胞及脉管癌栓内呈高表达，其水平与癌细胞的病理分级、临床分期和死亡风险呈正显著相关，因而推测NET-1是影响肝细胞癌预后的独立因素。宋晓花 等[13]通过对正常子宫内膜、增生及子宫内膜癌组织性免疫组化检测发现，NET-1在癌组织中的表达明显高于正常子宫内膜和良性增生组织，且NET-1的表达与病变的病理分级、病变分期及转移程度等均明显相关，提示NET-1是子宫内膜癌早期诊断、预后评估的重要指标。

本项研究从基因和蛋白两方面均证实，NET-1mRNA和蛋白在结肠癌组织中的表达均明显高于癌旁正常组织，表明NET-1的异常表达能促进结肠癌变的发生和发展，且NET-1表达越高，其对周围组织器官的侵袭能力越强，肝转移、淋巴结和血行转移风险越大，TNM分期越晚；进一步研究显示NET-1与结肠癌患者的生存期相关，NET-1表达越高，其生存期越短，预后越差，NET-1的表达是结肠癌患者预后的重要危险因素。因而，NET-1检测可作为结肠癌患者预后的重要生物学指标。

综上，NET-1的异常表达参与了结肠癌的发生和进展过程，且与结肠癌患者的预后相关，但目前对其具体的致癌机制及相关通路的研究尚不明确，这也将是本课题下一步的研究方向。