长链非编码RNA uc002ktr.3在肺鳞癌顺铂耐药中的作用研究

王 琪，罗 朋，王保龙

肺癌是全球发生率和死亡率很高的常见恶性肿瘤之一，居各种癌症死亡之首[1]。肺鳞癌是非小细胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC)常见的病理类型。与肺腺癌相比，其发病机制的研究和治疗进展明显滞后[2]。目前铂类为基础的化疗仍然是肺鳞癌主要的治疗手段之一，但目前化疗失败的主要原因是其耐药性的产生[3]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一类转录本长度超过200 nt的RNA，由于缺乏明显的开放阅读框，无蛋白质编码功能，曾一度被认为是基因组在进化过程中转录所产生的“噪音”，不具备任何生物学功能[4]。现已证实，lncRNAs与细胞周期、信号转导以及细胞凋亡等途径密切相关进而介导肿瘤的发生、发展、转移和药物耐受等[5]。前期本课题组通过肺鳞癌患者来源的肿瘤移植瘤(patient derived tumor xenograft, PDTX)模型筛选出肺鳞癌顺铂相对耐药和敏感的组织[6]，为鉴定lncRNAs在肺鳞癌顺铂耐药中的调控作用，该研究拟检测肺鳞癌顺铂相对耐药和敏感的组织中lncRNAs表达谱，采用小干扰RNA技术(siRNA)下调长链非编码RNA uc002ktr.3的表达，研究uc002ktr.3对肺鳞癌顺铂耐受性的影响及机制，为肺鳞癌诊断和治疗提供新的靶标。

1 材料与方法

1.1 材料肺鳞癌SK-MES-1细胞株(中国科学院上海生命科学研究院)；胎牛血清(美国Gibco公司)；DMEM高糖培养基、0.25%胰酶(南京Wisent公司)；TRIzol试剂、Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司)；uc002ktr.3-siRNA及其阴性对照siRNA-NC(上海吉玛科技有限公司合成)；荧光定量PCR检测试剂盒(日本Takara公司)；Quick Amp Labeling Kit 荧光标记RNA试剂盒(美国Agilent公司)；总RNA提取纯化试剂盒RNeasy Mini Kit(美国Qiagen公司)；长链非编码RNA引物(安徽通用生物公司合成)；顺铂、CCK8检测试剂盒(美国Sigma公司)；β-actin、GAPDH、Zeb1和E-cadherin抗体(美国Proteintech公司)；Annexin V/PI法细胞凋亡检测试剂盒、细胞总蛋白提取试剂盒(南京Vazyme Biotech公司)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 用10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养细胞SK-MES-1细胞，培养箱环境：37 ℃、5% CO2。待培养瓶内细胞生长达90% 融合度时进行传代，取对数生长期的细胞进行后续实验，整个培养过程中不加抗生素。

1.2.2LncRNA基因芯片检测及数据分析 抽提样品的总RNA，质检合格的RNA进行纯化。RNA样本通过Quick Amp Labeling Kit进行标记，杂交后清洗、甩干。通过RNeasy Mini Kit纯化标记的cRNA。用芯片扫描仪采集杂交后的图像，使用Agilent Feature Extraction软件(v11.0.1.1)处理相关数据。设定Fold Change≥2为数据筛选的标准，获取lncRNAs的差异表达谱。将表达基因或者差异基因数据做聚类分析，通过聚类热图(heatmap)直观地展现基因在不同样本中的表达情况。

1.2.3细胞瞬时转染 用胰蛋白酶消化对数生长期的SK-MES-1细胞，按照40%～60%密度将细胞接种于6孔板，培养24 h后进行转染。按照Lipofectamine 2 000转染试剂说明进行操作，将3条uc002ktr.3-siRNA基因序列和siRNA-NC序列分别转染于SK-MES-1 细胞中。转染24 h后，用TRIzol试剂收集细胞并提取细胞总RNA，通过qRT-PCR验证uc002ktr.3转染后的干扰效果。

1.2.4CCK-8检测体外顺铂药物敏感性变化 将uc002ktr.3-siRNA和siRNA-NC分别转染SK-MES-1细胞24 h后，胰蛋白酶消化，以 3×104/孔密度接种细胞于96孔板中。24 h后更换含不同终浓度的顺铂培养基，分别以 0、2、4、6、8、16 μmol/L的浓度进行加药，以不加药的一组为阴性对照(NC)组，平行设置5个复孔。37 ℃孵育48 h后, 每孔加入10 μl的CCK-8，温箱继续培养4 h后，自动酶标仪测定490 nm处的吸光度(A)值。通过细胞的生长抑制率(%)公式，最终由软件计算出半数抑制浓度(half inhibition concentration，IC50)值。

1.2.5Annexin V FITC/PI法检测细胞凋亡率 以3×105/孔接种细胞于6孔板中，将uc002ktr.3 siRNA和NC分别转染 SK-MES-1细胞，转染24 h后，加入终浓度为20 μmol/L的顺铂。12 h后收集细胞，PBS洗涤细胞3次，按Vazyme凋亡检测试剂盒操作说明采用Annexin V FITC/PI法双染，在1 h内上流式细胞仪检测，检测试验组和对照组细胞的凋亡率变化。通过公式计算细胞的细胞凋亡率(%)=(细胞早期凋亡数+细胞晚期凋亡数)/总细胞数×100%。

1.2.6Western blot检测转染后细胞Zeb1及E-cadherin蛋白表达变化 将uc002ktr.3-siRNA和siRNA-NC分别转染SK-MES-1细胞，作用72 h后加入细胞裂解液裂解细胞，提取总蛋白，二辛可酸法(BCA 法)进行蛋白定量。以同等质量的蛋白上样并进行SDS-PAGE电泳，电转移分离后的蛋白质至硝酸纤维素(NC)膜上，电转90 min后用10%脱脂牛奶室温封闭3 h，再分别加入Zeb1(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶6 000)抗体，4 ℃孵育过夜。TBST洗膜5次，每次6 min。加入二抗(1 ∶6 000稀释)，室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。进行ECL增强化学发光检测，以GAPDH作为内参，分析Zeb1和E-cadherin蛋白表达情况。

2 结果

2.1 相对耐药和敏感肺鳞癌组织中lncRNA的差异表达前期通过构建PDTXs，课题组筛选出顺铂相对耐药和敏感的肺鳞癌组织。本研究分别选取耐药和敏感的肺鳞癌组织各2例，根据lncRNAs 在不同样本中的差异表达水平进行聚类分析发现，相对于顺铂敏感组，耐药组中差异表达上调2倍的lncRNAs有644个，表达下调2倍的lncRNAs有576个。系统树状热图显示样本差异上调变化最大的前20个lncRNAs和下调变化最大的前20个lncRNAs(图1)。其中每列代表一个样本，R组代表顺铂耐受，S组代表顺铂敏感。每行代表一个lncRNAs，红色代表高表达，绿色代表低表达。最终选取lncRNAuc002ktr.3作为研究对象，芯片结果提示其在耐受组中表达显著上调。

图1 顺铂敏感和耐药肺鳞癌组织中lncRNA的差异表达

2.2 干扰uc002ktr.3后肺鳞癌细胞顺铂敏感性变化为进一步验证uc002ktr.3在肺鳞癌顺铂药物耐受性中所发挥的作用，首先通过siRNA干扰肺鳞癌SK-MES-1细胞中uc002ktr.3的表达，并由qRT-PCR检测基因干扰效率。3条siRNA(siRNA-1、siRNA-2和siRNA-3基因序列)分别转染细胞后，与siRNA-NC组相比，uc002ktr.3表达水平分别下降至(0.59±0.07)、(0.51±0.05)和(0.64±0.08)，差异有统计学意义(F=61.691，P<0.01)，见图2A。选取干扰效果最好的siRNA-2序列用于后续实验。通过转染siRNA降低SK-MES-1中的uc002ktr.3表达水平，利用CCK-8法检测uc002ktr.3-siRNA组与siRNA-NC组对顺铂药物敏感性变化。uc002ktr.3-siRNA组与siRNA-NC组对顺铂药物IC50分别为(7.4±1.6)μmol/L和(16.0±3.5)μmol/L，差异有统计学意义(t=-3.982，P<0.01)，见图2B，结果提示降低uc002ktr.3可增加肺鳞癌细胞对顺铂的敏感性。

图2 干扰uc002ktr.3对SK-MES-1细胞顺铂敏感性的影响

A：3条siRNA干扰SK-MES-1细胞后uc002ktr.3的相对表达水平；1：siRNA-NC组；2：siRNA-1序列组；3：siRNA-2序列组；4：siRNA-3序列组；与siRNA-NC组比较：**P<0.01；B：uc002ktr.3-siRNA-2序列对SK-MES-1细胞顺铂IC50的影响；a:siRNA-NC组;b:uc002ktr.3-siRNA组;与siRNA-NC组比较：##P<0.01

2.3 干扰uc002ktr.3后顺铂诱导肺鳞癌细胞凋亡率的变化流式细胞术(FCM法)检测发现，在相同剂量顺铂药物(20 μmol/L)的诱导下，干扰了uc002ktr.3的SK-MES-1细胞凋亡率(39.93±2.03)%显著高于siRNA-NC组(20.63±1.90)%，差异有统计学意义(t=18.24，P<0.001)，见图3。这表明干扰uc002ktr.3表达可增加顺铂诱导的细胞凋亡，从而增加肺鳞癌细胞对顺铂药物的化疗敏感性。

图3 干扰uc002ktr.3后流式细胞仪检测顺铂对细胞凋亡的影响

2.4 干扰uc002ktr.3后Zeb1和E-cadherin蛋白表达的变化Western blot结果证实，通过siRNA降低SK-MES-1细胞uc002ktr.3的表达水平后，相对于siRNA-NC组，Zeb1蛋白表达显著降低而E-cadherin蛋白表达显著增加(t=-12.84，P<0.01；t=7.20，P<0.01)，见图4，说明高表达的uc002ktr.3可能通过上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition, EMT)进而促进肺鳞癌细胞耐药表型产生。

图4 Western blot法检测SK-MES-1细胞中Zeb1

A：siRNA-NC组；B：uc002ktr.3-siRNA组；与siRNA-NC组比较：**P<0.01

3 讨论

目前，肺腺癌的靶向治疗已取得显著进展，但由于肺鳞癌缺乏有效的分子靶标，以铂类药物为基础的化疗仍然是其治疗的主要手段，然而耐药却大大阻碍了肺鳞癌的治疗疗效[7]。顺铂抗肿瘤作用主要是通过作用于细胞的DNA链，造成 DNA不可逆性的损伤[8]。在顺铂诱导肿瘤细胞发生凋亡受到抑制时，细胞对顺铂的敏感性下降，继而发生肿瘤细胞顺铂耐药。近来研究[9-10]表明，大量化疗药物顺铂、卡铂、紫杉醇和长春瑞滨等耐药都与EMT密切相关, EMT是上皮来源恶性肿瘤获得侵袭迁移能力的重要生物学过程，目前已经成为肿瘤侵袭转移及治疗抵抗研究领域的热点。在EMT进程中，最主要的生物标记分子E-cadherin表达会减少，另外还涉及其他分子标记物的表达变化，如波形蛋白(Vimentin)、神经钙粘素(N-cadherin，N-cad)、β-联蛋白(β-catenin)及Zeb1蛋白等[11]。通过EMT，上皮细胞失去与基底膜的连接等上皮表型，获得了较高的侵袭迁移和抗凋亡等间质表型。Luo et al[12]发现，lncRNA H19能激活Wnt/β-catenin信号通路，影响EMT进程，从而促进膀胱癌细胞的侵袭转移。

随着高通量测序、基因芯片等技术的兴起，研究发现lncRNAs的差异表达水平与恶性肿瘤耐药密切相关。高表达的人母系表达基因(maternally expressed gene 3，MEG3)与肿瘤耐药密切相关，过表达的MEG3能通过活化p53，抑制Wnt/β-catenin信号通路中相关蛋白表达水平，从而诱导细胞凋亡，改善NSCLC患者的化疗敏感性[13]。长链非编码RNA GAS5(growth arrest-specifc transcript 5，GAS5)具有肿瘤抑制功能，高水平的GAS5能通过调节抑制细胞的自我吞噬，诱导细胞凋亡，来充分发挥抑癌基因的作用[14]。但是，目前相关的lncRNAs的研究尚在探索阶段，亟需进一步了解lncRNAs 在肺鳞癌的功能和机制，为临床诊治肺鳞癌患者提供更多的帮助。

为了探究lncRNA在肺鳞癌顺铂耐药中的分子机制，课题组前期利用已经构建好的肺鳞癌PDTX模型，成功筛选出了顺铂敏感和耐受的肺鳞癌移植瘤组织。本研究进一步通过对顺铂敏感和耐受的肺鳞癌组织中lncRNAs的表达谱进行分析，共有1 220个lncRNAs存在差异性表达(差异倍数>2.0)，相对于顺铂敏感组，耐药组中差异表达上调2倍的lncRNAs有644个，选取了lncRNA uc002ktr.3作为研究对象。为进一明确步uc002ktr.3在肺鳞癌顺铂耐药中的作用，采用siRNA技术干扰uc002ktr.3表达，通过CCK-8实验证实了降低uc002ktr.3表达增加 SK-MES-1对顺铂的敏感性。在相同剂量顺铂药物的诱导下，流式细胞术结果表明这种耐药性与化疗药物诱导的凋亡相关，降低uc002ktr.3表达后，细胞凋亡比率显著增高。此外，降低uc002ktr.3表达，Western blot结果发现EMT相关蛋白Zeb1表达下降，E-cadherin表达显著增高，表明uc002ktr.3可能通过诱导EMT形成，进而影响肺鳞癌细胞顺铂耐药性。然而，uc002ktr.3诱导EMT、促进肺鳞癌耐药的具体机制，尚有待进一步深入探索研究。