人巨细胞病毒US31蛋白特异性抗体的制备及鉴定

陈碧，谢尚丹，项超丽，施昕妤，郭刚强，欧阳敬中，沈贤

（1.温州医科大学 第二临床医学院，浙江 温州 325035；2.温州市人民医院 肿瘤外科，浙江 温州 325000；3.温州医科大学 基础医学院，浙江 温州 325035）

人巨细胞病毒（humancytomegalovirus，HCMV）作为一种条件致病病毒，不仅是艾滋病、器官移植等免疫功能缺陷患者的严重致病原，也是引起围生期感染、新生儿疾病和先天畸形的常见病原体[1-4]。HCMV基因组由长独特序列（unique long region，UL）和短独特序列（unique short region，US）以及两端的反向重复序列组成[3]。US31基因位于US30和US32之间，增殖相关的立即早期蛋白2（immediate early protein 2，IEP2）可抑制US31表达，提示可能是HCMV潜伏感染的建立与维持所必需的基因[1]。 前期研究表明，US31基因的蛋白表达可刺激巨噬细胞向M1巨噬细胞表型分化并直接与NF-κB2相互作用，导致磷酸化p100的多聚泛素化和NF-κB2的激活，提示HCMV蛋白US31在系统性红斑狼疮的发病中起着诱导NF-κB介导的单核巨噬细胞的炎症反应的作用[2]。本研究进行了HCMV US31基因的蛋白表达、纯化及其多克隆抗体的制备、纯化，经鉴定证实，获得高表达HCMV US31编码蛋白和其特异性IgG抗体，为进一步研究HCMV US31生物学功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试剂和酶类：预染蛋白Marker、DNA聚合酶、限制性核酸内切酶Nde I和Xho I均购自Fermentas公司，PCR产物纯化试剂盒、1 kb DNA Marker、DNA Marker DL2000均购自天根生化科技（北京）有限公司，氨苄青霉素购自济南齐鲁药厂，异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）购自德国默克公司，小鼠抗His单克隆抗体购自上海Abmart公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG（H+L）单克隆抗体和HRP标记的羊抗小鼠IgG（H+L）单克隆抗体购自杭州联科生物技术有限公司，镍螯合亲和层析胶体（Ni-NTAAgarose）购自美国Qiagen公司，脱脂奶粉购自美国BD公司，蛋白酶抑制剂、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂购自美国Sigma公司。

1.1.2 质粒和菌株：pET21a（+）表达载体和E.coli BL21（DE3）均购自美国Invitrogen公司。表达US31蛋白的重组腺病毒（Ad-US31）由本实验室构建并长期保存。

1.1.3 实验动物：健康新西兰大白兔，雌性，体质量为（2.5±0.2）kg，4～5周龄，由温州医科大学实验动物中心提供，动物许可证号：SYXK（浙）2019-0009。

1.2 方法

1.2.1 HCMV US31原核重组质粒的构建及鉴定：参照HCMV US31基因序列（GenBank accession number：GU937742），通过生物网站（http：//www.jcat.de/）进行原核表达密码子优化，交由北京擎科生物有限公司全序列合成后，克隆入pET21a（+）载体中，获得pET21a（+）/HCMV US31重组质粒。将重组质粒转化到E.coli BL21（DE3）感受态细菌中，氨苄平板筛选阳性克隆并用T7通用引物进行PCR验证，提取阳性克隆质粒后分别进行酶切和测序鉴定。质粒的提取、酶切、转化等操作按分子克隆常规方法进行。

1.2.2 HCMV US31重组蛋白的表达、鉴定及纯化：按1:100的比例接种至LB培养液中，再按1:50的比例接种至LB/Amp中。培养至OD600=0.6时，加入IPTG，37 ℃诱导后12 000×g离心，收集细菌。用8 mol/L尿素溶解细菌后，进行12%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，摸索最适IPTG浓度及诱导时间。小鼠抗His单克隆抗体为一抗（1:5 000），HRP标记的羊抗小鼠IgG（H+L）单克隆抗体作为二抗，进行Western blot法分析和鉴定。经SDS-PAGE和Western blot法鉴定后进行HCMV US31重组蛋白的纯化。收集经IPTG诱导表达的菌 液，8 mol/L尿素重悬。用高压细胞破碎仪破碎菌液后，离心20 min，弃沉淀。过滤上清，分别用终浓度为10、50、100、200、500 mmol/L咪唑洗脱镍 柱，收集100和200 mL洗脱液进行透析，后进行超浓缩以获得高浓度的US31蛋白，以用于后期制备抗体的免疫原和进行效价评价的抗原。

1.2.3 HCMV US31多克隆抗体的制备：用纯化后的HCMV US31蛋白免疫新西兰大白兔（pUS31组）。初次免疫取200 μg纯化的蛋白稀释于1.5 mL的无菌PBS溶液内，加入等体积的完全弗氏佐剂充分乳化，于兔子腹部多点皮下注射；此后在第2、第4、第6周，取200 μg纯化的重组蛋白稀释于1.5 mL的无菌PBS内，加入等体积的不完全弗氏佐剂充分乳化，加强免疫3次。同时设计对照组（PBS组），每组3只。于第0、第2、第4、第6周从兔耳缘静脉取血，第8周兔心脏取血，收集的血液于37 ℃下静置1 h，3 000×g，4 ℃离心5 min，分离血清并分装，置于-80 ℃下保存备用。

1.2.4 HCMV US31多克隆抗体鉴定及效价分析：将纯化的HCMV US31蛋白以10 μg/mL的浓度包被ELISA 板，置于4 ℃下过夜，经洗涤、封闭后，pUS31组加HCMV US31蛋白免疫兔血清（1:100）作为一抗，PBS组加PBS免疫兔血清（1:100）作为一抗，二抗均为HRP标记的羊抗兔IgG（H+L）单克隆抗体（1:1 000）。反应结果置BioElx800酶标仪于450 nm处读取吸光度值，所有血清标本均重复3孔检测，取平均值，并以PBS作为阴性对照，不加一抗作为空白对照。同 时，对第6周收集的血清抗体进行效价检测，血清倍比稀释度分别为1:40、1:160、1:640、1:2 560、1:10 240、1:40 960、1:163 840。

1.2.5 HCMV US31多克隆抗体的纯化：根据IgG抗体纯化试剂盒说明书（Pierce Cat.No.22852），取HCMV US31蛋白免疫6周兔血清2～4 mL，加入等体积的结合缓冲液稀释，离心去除油脂及杂质。用10 mL结合缓冲液平衡亲和柱后，加入血清，使IgG被充分结合，用结合缓冲液洗涤后，分次将洗脱液（1～2 mL/次）加入柱内洗脱IgG至加有1 mol/L Tris的EP管内，洗脱柱内可能残留的IgG。检测血清样品洗脱液OD值，混合OD值＞0.1的洗脱液加入不完全培养基至14～15 mL，移入浓缩管，离心至体积剩余约250 μL，弃去管内废液后重复更换缓冲液2～3次，移至EP管，取150 μL不完全培养基洗涤浓缩管，重复1～2次，洗涤液同样加入到EP管中。用Millex-GV滤器将经浓缩的IgG溶液过滤。混合 10 μL纯化的IgG和190 μL不完全培养基，测定混合液的OD280值并计算IgG浓度及体积。

1.2.6 Western blot及免疫荧光法验证US31抗体的特异性：将表达US31的重组腺病毒Ad-US31（Ad-US31组）及不含目的基因病毒（Control组）转染HEK293T细胞，于转染24 h后收集总蛋白，以本研究制备的US31纯化多克隆抗体作为一抗（1:5 000），羊抗兔IgG单克隆抗体作为二抗（1:1 000）进行US31蛋白的Western blot检测和免疫荧光定位。

2 结果

2.1 pET21a（+）/HCMV-US31重组质粒构建 抽提构建后的pET21a（+）/HCMV US31重组质粒存在超螺旋、环状和线性3种构型，见图1A。电泳后出现多个条带，经Nde I和Xho I酶切消化后，电泳结果显示在492 bp处出现目的片段，经测序鉴定，序列完全正确。见图1B。

图1 HCMV US31原核表达重组质粒的构建和鉴定

2.2 HCMV US31蛋白原核表达和鉴定 pET21a（+）/HCMV US31重组质粒诱导6 h后，经SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色，在相对分子质量约20 kDa的位置可见一条明显的蛋白条带；其中IPTG浓度为1.0、 1.2 mmol/L时目的蛋白含量较多，而未诱导的对照组菌液则不出现目的条带，见图2A。IPTG诱导后的重组质粒在相对分子质量约20 kDa处表达特异性的蛋白条带，而空载体和未诱导的对照组质粒均不存在目的条带，与预期结果一致，见图2B。将pUS31蛋白进行大量诱导表达并高压破菌，镍柱纯化pUS31全长蛋白，并以不同浓度的咪唑洗脱，SDS-PAGE电泳显示，US31主要存在于100、200 mmol/L咪唑洗脱液中，纯化后浓度可达500 ng/μL，见图2C。

2.3 HCMV US31特异性抗体的效价分析 pUS31组于免疫后第2周开始产生特异性IgG抗体，至第6周达到高峰，见图3A。间接ELISA法检测的第6周血清IgG抗体效价高达1：40 960，见图3B。

2.4 HCMV US31多克隆抗体的鉴定 Ad-US31组转染的HEK293T细胞表达US31蛋白，Control组转染的细胞则无目的蛋白表达，见图4A。Ad-US31组及Con-trol组转染的293T细胞作用时，Control组病毒转染的细胞未见红色荧光，Ad-US31组转染的HEK293T细胞可见红色荧光，且大部分位于细胞核周，见图4B。

3 讨论

图2 pUS31蛋白原核表达和纯化鉴定图

图3 HCMV US31特异性抗体效价分析

图4 US31特异性抗体检测HEK293T细胞中目的蛋白的表达

当机体免疫力低下时，潜伏感染的HCMV被激活，常导致移植失败、HCMV肺炎、肝炎甚至死亡等严重后果[4-5]。HCMV US31由162个氨基酸构成，相对分子质量为20 kDa。目前US31的生物学功能尚不完全清楚，有研究证实pUS31表达受IEP2的调控，IEP2是HCMV增殖性感染重要标志，说明US31在HCMV潜伏感染过程中可能发挥一定的作用[6-8]。HCMV US31核苷酸仅有少量变异，其核苷酸同源性高达98.1%～100%，几乎全部是同义突变[2，7-9]。此外，US31基因氨基酸序列高度保守，同源性大小为99.3%～100%，说明该结构对于HCMV的生物学功能具有重要的意义，宿主的抗病毒选择压力保留了这段基因的稳定性，与AD169株gL蛋白的序列变化高度相似[10]。

前期发现，系统性红斑狼疮患者PBMC中表达的US31可通过促进NF-κB2的激活改变单核巨噬细 胞的免疫功能，促进M1的炎症反应，其可能机制 是，US31可以充当E3样连接酶并促进磷酸化p100的泛素化和蛋白酶体加工从而激活NF-κB2途径[10-11]。

本实验通过构建原核表达载体pET21a（+）/HCMV US31，并在大肠杆菌中进行了原核表达和纯化，获得融合蛋白，相对分子质量为20 kDa，与预期一致。融合蛋白主要以可溶性的形式表达，为后续的蛋白质纯化提供了便利，而且目的蛋白无需经过变性再复性的过程，更大程度保留了蛋白质的活性。另外，在构建重组质粒时，增加了6个His-Tag （组氨酸标签）的基因序列。His-tag无免疫原性，对蛋白质的分泌、折叠、功能基本无影响，但能高度亲和镍离子，使得亲和纯化的效率大为提高。

特异性抗体在免疫学研究和诊断实验技术中应用广泛[11]。本实验使用纯化的融合蛋白免疫家兔，获得效价高达1:40 960的特异性抗体，证实US31蛋白具有较强的免疫原性。本研究进一步分析US31抗体的特异性，Western blot、免疫荧光均证实本研究制备的抗体能特异性地识别真核表达的US31蛋白。本研究制备的US31蛋白及抗体可为进一步研究US31蛋白功能以及US31检测试剂盒开发提供基础。