复合软骨修复材料支架的构建

王莹莹，李花琼，2，赵子建

（1.温州医科大学 眼视光学院 生物医学工程学院，浙江 温州 325035；2.温州生物材料与工程研究所 生材事业部，浙江 温州 325000）

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料和试剂：α-1，3-半乳糖苷转移酶基因敲除猪（南京华贞生物医药科技有限公司）；GelMA（温州优墨生物科技有限公司）；骨髓间充质干细胞（美国ATCC）；Tris-HCl、十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、4%组织细胞固定液、中性树脂、Masson三色染色液（北京索莱宝生物科技有限公司）；Aprotinin、Leupeptin（德国Roche 公司）；PMSF（美国Sigma公司）；胎牛血清、低糖DMEM、0.25%胰酶（美国Gibco公司）；DNeasy Blood & Tissue Kit（德国QIAGEN公司）；胰蛋白酶（美国Biosharp公司）；苏木素伊红染色液、青霉素链霉素、DAPI（上海碧云天生物技术有限公司）；CCK-8试剂盒（日本同仁公司）；Live/Dead试剂盒（美国Thermo公司）；罗丹明标记的鬼笔环肽（上海翊圣生物科技公司）。

1.1.2 实验仪器：冰冻切片机、NanoDrop（美国Thermo公司）；扫描电镜（scanning electron microscope，SEM，日本Hitachi公司）；冷冻研磨仪（德国Retsch公司）；正置荧光显微镜（日本Nikon公司）；DHR流变仪（美国TA公司）；低温离心机（德国Eppendorf公司）；电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；全波长微孔读板机（美国BioTek精宏公司）；真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；精密分析型电子天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 脱细胞软骨的制备：取新鲜基因敲除猪软骨去除软组织及骨膜，切成约1.5 cm×0.5 cm×0.2 cm 的块状软骨，联合应用胰蛋白酶、去污剂、核酸酶、蛋白酶抑制剂对块状软骨进行脱细胞处理。具体脱细胞流程如下（每进行下一步前均用超纯水清洗软骨）：①将块状软骨放入Tris-HCl溶液（10 mmol/L， pH 8.0）中孵化24 h，控制温度于45 ℃；②在0.25%的胰蛋白酶溶液中消化24 h，保持温度37 ℃， 作用24 h；③放入含0.1% SDS的Tris-HCl溶液（10 mmol/L，pH 8.0）中24 h，恒温45 ℃；④用 含0.1% EDTA的PBS缓冲液，配制蛋白酶抑制剂 （PMSF 1 mmol/L、leupeptin 1 μg/mL、aprotinin 10 kIU/mL），放入该溶液中清洗2次，每次30 min，恒温37 ℃；⑤再次放入含0.1% SDS的Tris-HCl溶液（10 mmol/L，pH 8.0）中，恒温45 ℃，孵化24 h； ⑥在50 mmol/L，pH 7.5的Tris-HCl溶液中，配制氯化镁10 mmol/L、牛血清白蛋白50 μg/mL、DNA酶50 U/mL和RNA酶1 U/mL，置于该溶液中作用3 h，恒温37 ℃；⑦在含有0.1% EDTA、蛋白酶抑制剂的PBS缓冲液中，清洗2次，每次30 min，恒温37 ℃；⑧PBS缓冲液反复多次清洗，-80 ℃保存备用。

1.2.2 脱细胞软骨粉的制备：将脱细胞软骨骨块放在冷冻干燥机中冻干3 h，随后用冷冻研磨仪研磨成骨粉。设置研磨频率为20 r/s，时间为15 min， 循环2次。过筛选取粒径＜100 μm的骨粉，-80 ℃保存备用。

1.2.3 脱细胞效果检测：①DAPI染色检测脱细胞效果：将天然软骨、脱细胞块状软骨用冰冻切片机切成厚度为5 μm的切片，做好标记，在切片上滴加DAPI工作液，避光，室温孵育15 min，PBS漂洗3次，每次5 min，封片后荧光显微镜下观察。②软骨DNA含量检测：称取天然骨粉、脱细胞骨粉各20 mg，装入1.5 mL EP管中做好标记，取出DNeasy Blood & Tissue Kit，分别在EP管中加入180 μL Buffer ATL，20 μL蛋白激酶K，混匀，在56 ℃下孵育2 h直到组织裂解，在孵育过程中要间断振荡；加入 200 μL Buffer AL，混匀；加入200 μL无水乙醇，混匀；将上述混合物移至2 mL EP管中的DNeasy Mini滤柱中，6 000×g离心1 min后，弃去滤液、EP管；将滤柱放入新的2 mL收集管中，加入500 μL Buffer AW1，6 000×g离心1 min后，再弃去滤液、收集管；将滤柱放入新的2 mL收集管中，加入500 μL Buffer AW2，2 000×g离心3 min后，弃去滤液、收集管；将滤柱移至新的1.5 mL EP管中，200 μL Buffer AE加到滤柱膜中央洗提DNA，室温下孵育 1 min，6 000×g离心1 min，重复1次；用Nanodrop 检测DNA纯度、浓度，每个样品重复3遍，取平均值。③PCR检测β-actin基因的表达：β-actin引物序列：上游5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，下游5’-CTCCTTA ATGTCACGCACGAT-3’，反应条件为94 ℃ 3 min，30个循环94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃延伸 30 s，最后72 ℃ 5 min，4 ℃保存。反应结束后用2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统观察，拍照，分析。

2006年，我国颁布了新的《企业会计准则》。新准则改变了此前将全部开发支出当期费用化的做法，将研发活动分为研究阶段和开发阶段，并将开发阶段满足资本化条件的支出资本化，将研究阶段相关支出费用化。尽管新准则与国际会计准则更趋一致，但仍存在一定的缺陷。由于无形资产资本化有利于最大限度地发挥无形资产的作用，而新准则并未对研究阶段和开发阶段做出明确的划分，很大程度上仍依赖于企业自身的判断，因此企业为了追求利润最大化，必然会做出对自己有利的选择。那么，在做研发支出资本化的选择时，企业会考虑哪些因素的影响？是否会利用无形资产资本化条件进行盈余管理？

1.2.4 细胞外基质结构及胶原纤维成分检测：HE染色检测细胞外基质结构，步骤如下：将天然软骨、脱细胞块状软骨用冰冻切片机切成厚度为5 μm的切片，苏木素染色液染色10 min，自来水冲净多余的染液，蒸馏水洗涤5 s后，伊红染色液染色3 min， 洗净多余染液，甘油封片，于显微镜下观察拍照。Masson三色染色检测细胞外基质中胶原纤维成分，步骤如下：取天然软骨与脱细胞软骨切片，用配制好的Weigert铁苏木素染色液染色7 min；酸性乙醇分化液分化10 s，水洗；蓝化液返蓝5 min；蒸馏水洗1 min；丽春红品红染色液染色2 min；按蒸馏水：弱酸溶液按2:1比例配置，用弱酸工作液洗涤1 min；磷钼酸溶液洗1 min；弱酸工作液洗1 min；再直接放入苯胺蓝染色液中2 min；弱酸工作液洗1 min；最后封片，光学显微镜下观察。

1.2.5 SEM观察：收集脱细胞软骨骨粉，冷冻干燥过夜，用导电胶带将样品粘在铜片座上，对样品喷金处理后，用SEM观察骨粉形态。

1.2.6 制备脱细胞软骨/GelMA复合材料支架：以脱 细胞软骨粉、10% GelMA（取代度75%）前体为原料，按不同比例（0:100、20:80、35:65、45:55、50:50）均匀混合，加入0.5%（w/v）光引发剂[2-羟基-4’-（2-羟乙氧基）-2-甲基苯丙酮]，在聚四氟乙烯模具上用光强为18 mW/cm2，波长为365 nm的紫外光交联制备脱细胞软骨/GelMA复合支架（厚1 mm，直径8 mm）。

1.2.7 对支架进行表征：①溶胀性能检测：将复合支架放入37 ℃ PBS中，分别在5 min、10 min、20 min、30 min、1 h、2 h、4 h称重，称重前用滤纸将表面溶液吸干，记支架质量为Wt。达溶胀平衡的支架放入冷冻干燥机中冻干24 h，称重记质量为W0。按下述公式计算支架质量溶胀P（w），重复3次，P（w）=Wt/W0。②储能模量检测：用DHR流变仪8 mm 的平行板夹具，设置1%的形变，37 ℃下，在0.1～10 Hz范围内进行振荡频率扫描测试，测不同骨粉含量支架的储能模量，每组3个重复样品。计学分析。计量资料以s表示，2组比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

1.2.8 支架上细胞增殖实验：首先进行骨粉灭菌：将天然软骨骨粉、脱细胞软骨骨粉，浸入75%乙醇溶液中灭菌24 h，之后离心去上清液，将骨粉放入冷冻干燥机中干燥过夜。将GelMA溶于PBS缓冲液中，配制成10% GelMA溶液，在生物安全柜中用0.22 μm 的滤膜对其进行过滤，将过滤的光引发剂加入其中，浓度为0.5%，按上述不同比例均匀混合软骨骨粉和GelMA溶液，在96孔板中制备复合材料支架。在每个含有支架的孔板上，接种5 000个人骨髓间充质干细胞，在37 ℃，5% CO2培养箱中用低糖DMEM+10%胎牛血清+1%青霉素链霉素培养基培养 5 d，培养基每3 d更换1次。分别在第1、第3、第5天用CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒检测细胞活性。

1.2.9 支架上细胞Live/Dead染色：使用Live/Dead试剂盒评估支架上细胞活力。取细胞接种后第1、第7、第14天样品评估活力。设置激发/发射滤片488/530 nm观察活细胞（绿色），530/580 nm观察死细胞（红色）。Live/Dead试剂盒使用步骤：先根据说明书配置Live/Dead检测工作液；吸去样品中培养基后加入200 μL Live/Dead检测工作液，室温避光孵育25 min；吸去染液后用无菌PBS清洗3遍，加入1 mL PBS溶液，荧光显微镜下观察拍照。

1.2.10 支架上细胞骨架、细胞核染色：取干细胞接种后第7、第14 d的样品，用4%多聚甲醛固定，PBS清洗3遍。室温下用0.1%的Triton处理20 min后，避光下用罗丹明标记的鬼笔环肽（浓度为1:200）标记细胞骨架15 min，用PBS洗3次，DAPI工作液细胞核染色15 min。再用PBS清洗3次，加入1 mL PBS后，用荧光显微镜观察（红色荧光为细胞骨架染色，蓝色荧光为细胞核染色）。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS24.0软件进行统

2 结果

2.1 脱细胞效果 DAPI染色结果显示，天然软骨组织可见细胞核成分，而脱细胞软骨组织几乎无细胞核成分存在（见图1）。进一步DNA含量检测显示，天然软骨DNA含量为161.2 ng/mg，而脱细胞软骨DNA含量为15.27 ng/mg，与天然软骨组织比较差异有统计学意义。PCR结果显示正常软骨组织有显现β-actin基因条带，脱细胞软骨几乎无β-actin基因的扩增，平均灰度值差异有统计学意义（P＜0.01），见图2。

图1 DAPI染色结果

2.2 细胞外基质结构及胶原纤维保留情况 HE染色显示天然软骨组织可见细胞核，脱细胞软骨组织几乎未见细胞核，该种脱细胞方法效果明显，脱细胞彻底。天然软骨、脱细胞软骨细胞外基质均完整，组织结构清晰（见图3）。Masson三色染色结果显示脱细胞软骨组织细胞外基质存在胶原纤维成分，与正常软骨组织相比无明显差异，说明脱细胞过程对细胞外基质成分无明显影响。见图4。

图2 β-actin基因检测

2.3 脱细胞软骨骨粉SEM观察 SEM观察显示脱细胞软骨骨粉粒径小于100 μm，粒径足够小有利于后续可注射型水凝胶的制备，不容易堵塞注射针头。见图5。

图3 HE染色结果

图4 Masson三色染色结果

图5 脱细胞软骨骨粉SEM图

2.4 脱细胞软骨/GelMA复合材料支架 紫外光交联后不同骨粉含量的复合材料支架实物见图6（直径8 mm，厚度1 mm）。

2.5 脱细胞软骨/GelMA复合材料支架溶胀性能 支架在PBS溶液中质量溶胀分布在8%～14%，随脱细胞软骨骨粉含量增高，支架质量溶胀下降，差异有统计学意义（P＜0.05），见图7。

2.6 脱细胞软骨/GelMA复合材料支架储能模量 支架的储能模量分布在450～2 300 Pa，添加骨粉的支架储能模量比纯GelMA组高，添加骨粉能提升支架的力学强度，并且在低骨粉含量支架中，随着骨粉含量增加，支架的储能模量增大，力学强度增强，高骨粉含量支架储能模量反而稍低，见图8。

2.7 脱细胞软骨/GelMA复合材料支架细胞增殖情况 CCK-8检测显示支架上细胞呈增长趋势，在添加骨粉的支架中，随骨粉含量增加，支架上细胞增殖加快。且在第3、第5天，软骨含量为45%、50%支架上细胞数量与GelMA组比较差异无统计学意义 （P＞0.05），见图9。

2.8 脱细胞软骨/GelMA复合材料支架上细胞Live/Dead染色结果 染色结果显示细胞能黏附在支架上，并在支架上增殖，并且骨粉含量越高，细胞增殖越快。第14天，GelMA组、45%软骨粉组和50%软骨粉组细胞已铺满材料表面，见图10。

图6 不同骨粉含量复合材料支架实物图（直径8 mm）

图7 复合支架的溶胀性能

图8 复合支架的储能模量

图9 复合支架上细胞增殖情况

2.9 脱细胞软骨/GelMA复合材料支架上细胞骨架、细胞核染色结果 细胞骨架、细胞核染色显示各支架上细胞微丝呈红色，细胞核呈蓝色，染色较为清晰，细胞铺展好。第14天支架上细胞数量较多，有些染色结果重叠，尤其是GelMA、45%软骨粉、50%软骨粉支架，见图11。

3 讨论

图10 复合支架上细胞Live/Dead染色

骨关节炎以关节软骨丢失为特征，与骨肥大和囊膜增厚有关，表现为关节疼痛、压痛、活动受限、龟裂、渗出、局部炎症，可发生在任何关节，最常见的是膝、髋关节和手、脚、脊柱等处的关节。60岁以上男性发病率为9.6%，女性发病率为18%。在美国，30%成年人都会受关节疼痛、肿胀或运动受限的影响[2]。传统的软骨修复方法，有微骨折手术、软骨下钻孔术、骨软骨移植术、骨膜移植术等。微骨折术、软骨下钻孔术恢复周期长，形成的是无序的纤维软骨，在组织学上纤维软骨与正常透明软骨不同，导致疗效不佳[3]。自体骨软骨移植手术简单，是一次性手术，但是供源不足，难以维持软骨细胞表型，不能用于修复超过2 cm2的缺损[4]。同种异体骨移植可修复较大面积缺损，但会引起免疫排斥反应，存在疾病传播风险[5]。组织工程的发展解决了软骨修复的众多难题，然而异种生物材料植入灵长类体内后会发生特有的超急性排斥反应，该排异反应与异种内皮细胞表面α-1，3-半乳糖基糖蛋白分子有关。由于灵长类动物没有该糖分子，因此体内有大量的α-1，3-半乳糖基糖蛋白分子的抗体存在。这些抗体迅速激活补体反应，破坏异种组织内皮细胞而引起超急性排异反应。本研究采用的α-1，3-半乳糖苷转移酶基因敲除猪，具有低免疫原性，对其肋软骨脱细胞处理，保留了细胞外基质的同时进一步降低了免疫原性。尽管脱细胞过程能除去90%细胞，去除大部分异种抗原，但不能完全清除干净，异种组织仍会残留一小部分抗原，该基因敲除猪能从根源上降低免疫原性，不管在细胞内还是细胞外基质中都不存在α-1，3-半乳糖基糖蛋白分子，因而大大降低了异种生物材料移植的风险。美国麻省总医院已成功将基因敲除猪的肾脏、心脏移植到狒狒，克服了超急性免疫排斥反应[6]。

图11 复合支架上细胞骨架、细胞核染色图

脱细胞软骨细胞外基质就是通过脱细胞技术，清除了软骨中的细胞成分，保留了细胞外基质，移除了可能引起机体免疫排斥反应的潜在抗原[7]。软骨细胞外基质主要成分为 II型胶原蛋白、蛋白聚糖和水，具有良好的生物相容性，有利于细胞的黏附和增殖。有研究证明，细胞外基质能促进人干细胞向软骨细胞分化[8]。目前常用脱细胞方法有渗透溶液法、反复冻融法、机械振荡法、酶消化法、去污剂清洗法等[9]。反复冻融可有效裂解细胞，且不会造成细胞外基质蛋白成分的损失，但需联合其他方法提高细胞残余成分的去除。机械振荡法产生的能量会破坏细胞，可将细胞从基底膜分离，但这种直接机械力量会破坏基膜的完整和细胞外基质的超微结构。螯合剂能破坏蛋白与蛋白之间的联系，但对去除组织表面的细胞无明显作用，因此常和其他试剂联合使用，如酶类或去污剂。本研究采用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，可以让细胞从组织中分离出来，另外胰蛋白酶可以增加后续脱细胞试剂的渗透性，因此在脱细胞过程中成为必要步骤，特别是对致密组织[10]。再用去污剂SDS溶解细胞膜，进一步破坏细胞，提高脱细胞效果。核酸酶能裂解核酸序列并清除核酸物质。在脱细胞同时使用蛋白酶抑制剂，防止内源性蛋白酶释放破坏蛋白成分，更好地保存了软骨中的蛋白质[11]。最后用无菌PBS缓冲液反复清洗，去除残留的脱细胞试剂，降低细胞毒性。这种联合使用胰蛋白酶、核酸酶消化、去污剂清洗法，脱细胞效果达90%以上，比一般的反复冻融和去污剂清洗效果明显[12]。

水凝胶具有优异性能，多孔结构特别，水结合能力高，机械性能可控，降解性能可调，已广泛应用于细胞培养和组织工程领域，如海藻酸钠[13]、透明质酸[14]、明胶[15]、硫酸软骨素[16]等。注射水凝胶可同时包裹和缓释生长因子、传递药物，募集周围组织间充质干细胞向材料迁移，实现微创治疗，制备个性化软骨修复支架，减少患者痛苦及相关临床并发症，又能促进软骨再生，延缓关节炎发展[17]。GelMA材料就是其中一种常用水凝胶，有研究表明无论在体内外矿化还是血管化方面都具有很大潜 能[18-20]。

本研究筛选粒径小于100 μm的软骨骨粉，与GelMA凝胶溶液均匀混成形成可注射复合生物材料，制备复合支架，达到个性化修复软骨目的。溶胀性能与水凝胶网络交联密度有关，交联密度越高，溶胀率越小。该支架随脱细胞软骨骨粉含量增高，质量溶胀下降，可能是因为骨粉含量增多，支架结构更致密，PBS缓冲液难以进入，正符合研究需求。在低骨粉含量支架中，随骨粉含量增加，支架的储能模量增大，高软骨含量支架储能模量反而降低可能是因为高骨粉含量支架紫外光不能透过骨粉，交联不彻底。

本研究选取hMSCs检测细胞增殖情况，其取材方便，有极强的自我复制能力，多向分化潜能[21-22]， 具有调节免疫、抑制局部炎症反应的作用，还能促进造血，在软骨修复中发挥重要作用。研究表明它们可以从软骨下骨迁移到损伤部位，分化为软骨细胞和成骨细胞，整合周围组织和新生组织，修复软骨下骨组织和软骨[23]。细胞增殖曲线、Live/Dead染色、细胞骨架染色实验显示随时间推移，该支架上细胞呈增长趋势，且随骨粉含量的增加，细胞状态越好，增殖越快，可能是因为高软骨含量支架，生长因子、营养成分等细胞外基质越多，越有利于细胞生存。简言之，与纯GelMA组相比，通过可注射型生物材料（脱细胞软骨/GelMA复合材料）制备的支架虽细胞增殖速率稍慢，但质量溶胀更低，抗形变能力更强，能够与MSCs共培养，生物相容良好，具有低免疫原性，尤其是骨粉含量为45%和50%的2种支架。因而该支架是一种很有潜力的医用材料，能达到个性化修复目的。