法舒地尔对软骨细胞基质降解的影响及其机制

季恩成，周也立，陈成帷，陈春，李井，高伟阳，潘哲尔

（1.温州医科大学附属第一医院 骨科，浙江 温州 325015；2.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 手外科，浙江 温州 325027）

骨关节炎是以软骨的退变、软骨下骨硬化和滑膜炎症为特征的全球性疾病，并且最终诱发关节功能障碍[1]。如何有效延缓骨关节炎的进展，已成为该领域的一项亟待解决的难题。因此，很有必要探索一种有效的治疗骨关节炎的方法。法舒地尔是一种Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶（Rho associated coiledcoil forming protein kinase，ROCK）的新型抑制剂，最初被用于蛛网膜下腔出血患者，以缓解血管痉挛并改善其预后[2]。大量研究报道了其更为广泛的效应，例如抑制MAPK通路激活的作用[3]。虽然既往研究表明法舒地尔能有效对抗骨关节炎发生的疼痛，但关于法舒地尔在该领域的应用或分子机制的研究却很少。因此，本研究旨在观察法舒地尔对IL-1β诱导的大鼠软骨细胞外基质（extracellular matrix，ECM）降解的影响，并探讨其可能的作用机制，为骨关节炎的治疗提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料 由温州医科大学实验动物中心提供的清洁级1周龄雄性SD大鼠，动物使用许可证号：SYXK（浙）2015-0009。法舒地尔购于大连美仑公司；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）购于北京索来宝公司；重组IL-1β购于美国PeproTech公司；细胞计数试剂盒-8（CCK-8）购于日本Dojindo公司；COX-2、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38/p38和GAPDH抗体购于美国PeproTech公司；iNOS抗体购于美国Cell Signaling Technology公司；山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗小鼠IgG-HRP、Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG（H+L）二抗和RIPA裂解缓冲液购于上海碧云天生物技术有限公司；One Step TB Green Prime-Script RT-PCR Kit II购于美国Perfect Real Time公司；RNAiso Plus购于日本TaKaRa公司；F12/DMEM 培养基购于美国Gibco公司；前列腺素E2（PGE2）测定试剂盒和一氧化氮（NO）测定试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 大鼠软骨细胞的培养：将切下的软骨切成约0.4 mm大小，于含1%双抗PBS液冲洗3次，以1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入0.2% II型胶原酶在37 ℃温箱消化6 h，加入培养基终止消化，以200目滤网过滤，收集滤液，1 200 r/min离心 5 min，弃上清，将软骨细胞在含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素抗生素的DMEM/F12培养基中，在保持5% CO2，37 ℃的培养箱中培养，24 h后更换培养基。当细胞达到80%～90%的皿底面积时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA收集细胞。然后，将细胞以适当的密度接种到10 cm培养皿中。第3代的软骨细胞将用于所有实验。将软骨细胞置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养，并且每隔1 d更换培养基。

1.2.2 分组：CCK-8分组方法为：软骨细胞分别 加入0、1、2.5、5、10、20、50 μmol/L浓度的法舒地尔溶液，作用24 h后加入CCK-8并检测细胞活性。其余的细胞实验分组方法为：软骨细胞加入终浓度分别为0和10 ng/mL的IL-1β处理24 h后，再分别用终浓度为0与10 μmol/L的法舒地尔处理2 h。分为空白组、法舒地尔组（10 μmol/L）、IL-1β组（10 ng/mL）和IL-1β（10 ng/mL）+法舒地尔 （10 μmol/L）组。

1.2.3 CCK-8实验：根据说明书使用CCK-8试剂盒测定法舒地尔对软骨细胞活性影响。将大鼠软骨细胞接种到96孔板上，用递增浓度的法舒地尔（1、 2.5、5、10、20、50 μmol/L）培养细胞24或48 h，然后向每个孔中加入10 μL CCK-8，并将96孔板在37 ℃下孵育4 h。然后使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。将不加法舒地尔的对照组吸光度设为100%，其余各孔的吸光度则换算为对应的百分比。

1.2.4 qRT-PCR检测：使用RNAiso Plus分离总RNA。在以下反应条件下进行qRT-PCR：42 ℃下5 min， 95 ℃下10 s，然后进行40个循环；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s。在总体积10 μL中进行反应，其中含有1 μL总RNA，0.4 μL正引物，0.4 μL逆引物，5 μL一步SYBR缓冲液，0.4 μL酶混合物和2.8 μL的去离子水。将靶mRNA水平用GAPDH水平进行对照。使用2-ΔΔCT方法分析数据[4]。每个待检测指标重复至少3次。靶基因的引物序列分别为：二型胶原（Collagen- II）： 正向引物5’-CTCAAGTCGCTGAACAACCA-3’，反向引物5’-GTCTCCGCTCTTCCACTCTG-3’；MMP-13：正向引物5’-CTGCGGTTCACTTTGAGGA-3’，反向引物5’-TCTTCTATG AGGCGGGGATA-3’；GAPDH：正向引物5’-TGCCACTCAGAA GACTGTGG-3’，反向引物5’-TTCAGCTCTGGGATGACCT-3’。

1.2.5 Western blot检测：使用RIPA裂解缓冲液提取总蛋白质，再用BCA蛋白质测定试剂盒测定蛋白质浓度。将蛋白质样品（40 μg）上样到SDS-PAGE凝胶上进行电泳，转膜，5% BSA封闭2 h，将PVDF膜与相应的的一抗稀释液置于4 ℃过夜。然后与相应二抗室温孵育2 h。加入ECL显影液，于化学发光仪上曝光分析。

1.2.6 细胞免疫荧光检测：将软骨细胞以5×104个细胞/mL的密度接种在6孔板中，孵育24 h。将细胞在4%多聚甲醛中固定15 min，并在含有0.5% TritonX-100的PBS中通透15 min。在室温下用5%山羊血清孵育细胞1 h，并与MMP-13（1:200）抗体在 4 ℃温育过夜。第2天用PBS洗涤后，将细胞与荧光素缀合的山羊抗兔IgG抗体（1:250）一起孵育1 h，然后用DAPI标记5 min，使用荧光显微镜捕获图像。

1.2.7 NO和PGE2检测：细胞经过处理后收集并离心，得到细胞上清液。用硝酸还原酶法测定NO表达量[5]；上清液中PGE2的表达量则用ELISA测定。

1.3 统计学处理方法 采用SSPS18.0统计软件进行统计学分析。计量资料用s表示。多组间比较使用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t法。 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 法舒地尔对大鼠软骨细胞活力的影响 与 0 μmol/L法舒地尔比，20、50 μmol/L均能抑制软骨细胞增殖，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图1。因此随后的实验将选择浓度为10 μmol/L的法舒地尔作为相应的刺激浓度。

2.2 法舒地尔对大鼠软骨细胞p-MYPT、ROCK1和ROCK2表达的影响 与IL-1β组相比，IL-1β+法舒地尔组中ROCK1、ROCK2和p-MYPT蛋白的表达均降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图2。

2.3 法舒地尔对大鼠软骨细胞iNOS、COX-2、NO和PGE2表达的影响 与空白组比，IL-1β组中iNOS、COX-2、NO和PGE2的表达显著上调，差异有统计学意义（P＜0.05）；与IL-1β组比，IL-1β+法舒地尔组中iNOS、COX-2、NO和PGE2有显著下调，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

2.4 法舒地尔对大鼠软骨细胞MMP-13和Collagen- II 表达的影响 与空白组比，IL-1β组中MMP-13的表达显著增加，而Collagen- II的表达降低，差异有统计学意义（均P＜0.05）；与IL-1β组比，IL-1β+法舒地尔组中MMP-13表达降低，而Collagen- II的表达增加，差异有统计学意义（均P＜0.05），见图4。

2.5 法舒地尔对大鼠软骨细胞MAPK通路活化的影响 与空白组比，IL-1β组中p-ERK、p-JNK和p-p38的表达量提高，ERK、JNK与P38的磷酸化水平提高，差异有统计学意义（均P＜0.05）；与IL-1β组比，IL-1β+法舒地尔组中p-ERK、p-JNK和p-p38的表达量降低，ERK、JNK和p38水平降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图5。

图1 不同浓度法舒地尔对软骨细胞活力的影响

图2 法舒地尔对IL-1β诱导的软骨细胞ROCK1、ROCK2、p-MYPT蛋白表达的影响

图4 法舒地尔对IL-1β诱导的软骨细胞MMP-13表达和Collagen- II的影响

图5 法舒地尔对IL-1β诱导的软骨细胞MAPK通路活化的影响

3 讨论

目前，骨关节炎的早期治疗主要采取姑息性干预措施，包括运动减重，关节腔注射玻璃酸钠等；而当骨关节炎进展至中、晚期时，病情已难以逆转，膝关节成形术、截骨术等手术干预或成为最后的治疗手段。因此寻找一种有效的早期干预靶点，是骨关节炎的研究热点。降低关节软骨ECM降解水平可抑制骨关节炎的进展。目前，已有研究提出了法舒地尔通过抑制关节软骨ECM降解水平来治疗骨关节炎[6]，因此本研究为了验证法舒地尔的药理作用，进一步探究了法舒地尔对IL-1β刺激的软骨细胞的各项指标的影响。

在骨关节炎的发生发展中，ECM降解起着至关重要的作用。而Collagen- II作为ECM的重要成分，主要由MMP-13降解消化[7]。IL-1β的刺激与ECM的降解有关，并诱导iNOS和COX-2的表达，产生NO和PGE2，使得骨关节发生非细菌性的炎性改变。并且，NO在骨关节炎中诱导MMP表达并抑制Collagen- II分泌。PGE2在骨关节炎中具有重要的致病作用，例如抑制ECM合成，抑制软骨细胞增殖等[8]。我们还检测了iNOS和COX-2的蛋白质水平，实验结果表明表明法舒地尔降低了iNOS和COX-2的表达，降低了NO和PGE2的表达，也使MMP-13与Collagen- II表达接近对照组，这与我们的推测表现一致。

ROCK1和ROCK2是ROCK的2种亚型，而ROCK激活后，会磷酸化MYPT，使得p-MYPT的量增加。法舒地尔作为ROCK的抑制剂，可抑制IL-1β刺激的软骨细胞中ROCKs和p-MYPT增加。ROCK在骨关节炎的进展中得到了激活，是促进软骨ECM降解的重要机制之一。并且，鉴于ROCK被认为是MAPK途径的上游[9]，我们猜想骨关节炎中ROCK的异常激活状态使得下游的MAPK通路也被激活，而应用ROCK的抑制剂法舒地尔能够抑制ROCK，并使得下游的MAPK通路的激活状态得到抑制，从而减少了ECM的降解。MAPK通路在骨关节炎发生发展中起重要作用，由ERK，JNK和p38组成的MAPK通路的激活参与了MMP表达和软骨结构的破坏[10]，它们的磷酸化水平可表明骨关节炎进展的严重程度。应用IL-1β刺激诱导软骨细胞，可模拟骨关节炎条件下的ERK、JNK和p38的激活与磷酸化。在骨关节炎中， MAPK通路也位于iNOS和COX-2的上游，使其表达得到增加；也有研究指出MAPK通路的抑制可导致MMP-13表达的下调。因此，如果要抑制ECM降解，抑制MAPK通路的激活是可行的途径之一[11]。我们的实验证明应用法舒地尔可抑制MAPK通路，这一点也与以往的文献结果呈现一致。

综上所述，本研究初步证明法舒地尔对软骨ECM降解具有抑制作用，并且能下调促进骨关节炎性进展的炎症介质表达，其机制可能是通过抑制ROCK，继而抑制MAPK通路激活来起效的。本研究提示法舒地尔是一种潜在的治疗骨关节炎的药物。