基于TCGA 数据库对RUVBL1 基因在结肠腺癌中的诊断和预后价值研究*

龚艺贞，廖锡文，阮国添，闫岭，马辉△

1 广西医科大学第一附属医院结直肠肛门外科广西南宁530021

2 广西医科大学第一附属医院肝胆外科广西南宁530021

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是发生在结肠或直肠的恶性肿瘤，是世界上发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一［1-2］。超过60%的CRC发生在结肠，全球癌症数据显示2018年新增结肠癌病例1 096 601 例，死亡551 269 例，约占全部肿瘤的6%［1］。结肠癌与直肠癌的病因并不一样［1-4］，所以他们的发病机制也可能不同。手术切除仍是治疗结肠癌的主要手段，但大部分患者诊断时已非早期，术后生存期不长。良好的肿瘤标记物有助于肿瘤的早期诊断和预后预测。之前的研究发现血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是对CRC 诊断和术后监测较有意义的肿瘤标记物［5-7］，但是，CRC患者的血清CEA 阳性率在一些临床试验中低于50%［8-10］。因此，有必要寻找更好的生物学标志物以利于早期诊断结肠癌和预测患者的预后。结肠癌中最常见的病理类型是结肠腺癌（colon adenocarcinoma，COAD），本研究基于TCGA 数据库的COAD 数据集探索RUVBL1基因表达在COAD中的诊断和预后价值。

1 材料与方法

1.1 数据的来源

从TCGA（https://cancergenome.nih.gov；访问日期：2018年12月29日）下载COAD 的mRNA 测序数据集及病例相应的临床资料［11-12］。通过RUVBL1 基因在COAD 患者癌和癌旁正常结肠组织中的表达情况计算其表达差异及诊断价值。根据纳入样本RUVBL1基因表达量的中位数进行分组，其表达量高于中位值的定义为高表达组，反之为低表达组［13-14］，分析RUVBL1基因在COAD中的预后价值。本研究使用TCGA 数据符合TCGA 的出版指南（https://www.cancer.gov/about- nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga/using-tcga/citing-tcga），不需要伦理委员会批准。

1.2 统计分析

采用GraphPad Prism 7.0 软件（GraphPad Software, Inc, La Jolla, CA）绘制散点图、ROC 曲线和Kaplan-Meier 生存曲线。采用SPSS 22.0 版本（SPSS, Inc, Chicago, IL, USA） 行t 检验比较RUVBL1 基因在癌组织和癌旁正常结肠组的中的表达量，临床参数与COAD 预后的关系采用单因素与多因素Cox 风险模型进行分析，计算风险比（Hazard Ratio，HR）与95%置信区间（95% Confidence Interval，95% CI）量化评估临床参数与COAD 临床预后的相关性，为减小两组间选择性偏倚，作者将单因素分析中P ＜0.05的因素进行校正后再进行Cox 多因素分析。以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RUVBL1基因在癌组织和癌旁正常组织的表达

TCGA 中的结肠腺癌研究项目共有461 例COAD患者，其中456例患者的480个癌组织样本和41个癌旁正常组织样本有mRNA测序数据，RUVBL1基因在癌组织中的表达量为（2486.000 ± 39.590），高于其在癌旁正常结肠组织中的表达量（966.300 ±35.450），差异有统计学意义（P ＜0.001）。见图1A。

2.2 RUVBL1基因表达对COAD的诊断价值

以RUVBL1 基因在癌组织和癌旁正常结肠组的中的表达量绘制ROC 曲线，结果显示RUVBL1 基因对COAD有较高的诊断价值（AUC=0.972，95%CI:0.958～0.986）。见图1B。

2.3 RUVBL1基因表达与结肠癌预后的关系

临床资料含有461例COAD患者，排除有临床资料而无mRNA 表达量数据的5 例，有RNA 测序数据而无患者临床资料的2例、术后生存时间为未知的1例，以及术后生存时间为0的15例，最后纳入438例既有生存资料又有全基因组RNA 测序数据集的COAD患者进行生存分析。

2.3.1 RUVBL1 基因表达与总生存时间的关系Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示RUVBL1基因表达与总生存时间相关，低表达患者总体生存时间优于高表达患者（P=0.027）。见图1C。

2.3.2 影响COAD 患者预后的临床参数单因素及多因素Cox分析以生存结局（“生存”赋值0，“死亡”赋值1）为因变量，以性别（“男”赋值1，“女”赋值2）、年龄（“≤65岁”赋值1，“＞65岁”赋值2）、TNM分期（“I期”赋值1，“II期”赋值2，“III期”赋值3，“IV期”赋值4）及RUVBL1表达（“低表达”赋值1，“高表达”赋值2）为自变量对影响结肠癌预后的因素进行单因素及多因素Cox分析。

单因素分析结果显示患者性别、年龄均与患者的预后无关（Log-rank P = 0.545、0.114），而肿瘤TNM 分期（P ＜0.001）、RUVBL1 基因表达与COAD预后相关（Crude P=0.028；Crude HR=1.587，95%CI:1.051～2.397）。进一步进行校正肿瘤TNM 分期的Cox多因素分析，结果显示RUVBL1基因高表达是影响COAD 预后的独立危险因素（Adjusted P = 0.038；Adjusted HR=1.565；95%CI:1.026～2.386）。见表1。

3 讨论

CRC 治疗越早期效果越好，早期患者的存活率大约是晚期患者的5倍［15］，而在最初诊断CRC时，I期患者仅占15%［16］。结肠镜检查钳取组织行病理检查仍然是术前诊断CRC 的金标准，但这项检查具有侵入性，费用昂贵，患者依从性差。理想的肿瘤标记物对肿瘤的诊断具有较高的灵敏度和特异度，有助于早期发现肿瘤，然而既往对CRC 生物学标记物的研究并未获得理想的结果［17-22］，在CRC 的预后研究方面，目前研究发现一些有助于预测预后的标志物用于筛查复发或转移的风险［23-24］。但是它们在临床应用受限，并且由于检测技术和费用问题，一些检测手段仅能在规模较大的医疗机构中实施。TNM分期是预测预后的一个重要因素，但该分期系统在COAD临床应用中仍具有一定的局限性，仍然需要寻找效能更高的分子标志物对TNM 分期系统进行补充，以便对COAD进行更有效的诊疗［25-27］。

RUVBL1 基因编码一种同时具有DNA 依赖性ATP 酶和DNA 螺旋酶活性的蛋白质，属于与多种细胞活性（AAA+）蛋白质家族相关的ATP酶。编码蛋白与几个亚单位转录复合物以及参与ATP 依赖性重塑和组蛋白修饰的蛋白复合物相关（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?term=(ruvbl1 ［gene］)%20AND%20(Homo% 20sapiens ［orgn］)% 20AND% 20alive［prop］%20NOT%20newentry［gene］&sort=weight）。既往的研究发现RUVBL1 参与了多种细胞过程，包括转录调节、染色质重塑和DNA 损伤修复［28-29］，RUVBL1基因在多种恶性肿瘤中高表达并参与肿瘤的发生发展过程并预示着不良的预后［30-33］。Lauscher等人对115 例UICCⅡ期和Ⅲ期的原发性结肠腺癌组织RUVBL1蛋白免疫组化研究结果提示，接受辅助治疗的RUVBL1 阳性结直肠癌患者无复发生存率（P =0.008）和总生存率（P=0.011）低于接受辅助治疗的RUVBL1 阴性患者。在UICCⅢ期的结直肠癌中，RUVBL1 阳性结直肠癌无复发生存率下降（P =0.028）［34］。本研究结果显示RUVBL1基因对COAD患者有较高的诊断价值，且其在癌组织中高表达可增加COAD 患者死亡的风险，其总体生存时间较低表达RUVBL1基因的COAD患者更短，因此初步认为其可作为一个具有潜力的结肠腺癌诊断和预后预测的分子标记物。

图1 RUVBL1基因在COAD患者癌组织和癌旁正常组织中表达情况及其在COAD患者癌组织中表达的高低与预后的生存分析

表1 影响COAD患者预后的临床参数单因素及多因素Cox分析

本研究发现RUVBL1 基因可能在结肠腺癌诊断和预后预测方面有一定的指导意义，但本研究仍存在一些局限性：（1）来自TCGA数据库的临床信息不完善，一些重要的信息如肿瘤大小、组织学分型、分化程度等未能提供；（2）本研究的样本量有限，未来需要在更大样本人群和多中心、多区域、多民族人群中进行验证；（3）需要进行功能试验，进一步探讨RUVBL1 基因在COAD 的发生、发展、转移、增殖和血管生成中的作用机制。

本研究结果提示RUVBL1 基因可能是COAD 诊断和预测预后潜在的生物学标记物，但是该结果仍需要在未来更进一步的大样本和多中心队列中进行验证。