丹蒌片调控心肌细胞钙超载的变化及其信号分子机制*

谭亚芳 梁玮婷 潘文君 祁建勇 张敏州△

（1.广州中医药大学第二附属医院，广东 广州 510120）；2.广州中医药大学，广东 广州510006）

据国家心血管病中心最近发布的报告显示，心血管病占居民疾病死亡构成的40%以上，为我国居民的首位死因，其中冠心病死亡率在逐年上升。心肌缺血再灌注损伤是个复杂的病理过程，与氧自由基、钙超载、能量代谢障碍等密切相关［1-2］。钙超载是心肌细胞损伤和死亡的共同通路［3］，故防治钙超载是阻止心肌缺血再灌注损伤的重要举措。“钙超载”是心肌细胞电重构的关键，也可能是心肌缺血发生并持续的重要基础。丹蒌片是痰瘀同治法的代表方药，由瓜蒌皮、薤白、丹参、赤芍等10味中药组成，诸药合用，攻补兼施，泻实补虚，标本兼治，具有宽胸通阳、活血化瘀、化痰散结的功效。临床上主要用于治疗心血管类疾病，如心绞痛、急性心肌梗死等［4］，对高脂血症、稳定型心绞痛、支架植入术后患者及非血运重建急性冠脉综合征患者均有确切的疗效［5］，而且还可以抑制炎症反应，起到稳定斑块及抗氧化的作用［6］。本课题组采用连二亚硫酸钠（Na2S2O4）建立大鼠心肌细胞的缺氧模型，运用激光共聚焦检测Na2S2O4对心肌细胞内钙离子浓度的影响，在此基础上观察丹蒌片，钙调蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）抑制剂KN93对大鼠心肌细胞钙负荷的影响，并对细胞CaMKⅡ及磷酸化钙调蛋白依赖性激酶（P-CaMKⅡ）的变化进行检测，其目的旨在进一步探讨丹蒌片、细胞钙超载和CaMKⅡ三者之间的关系，有助于阐明丹蒌片对心肌缺血保护作用的确切机理，并为今后研究DLT防治心肌缺血再灌注损伤的可行性奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 药物与仪器 丹蒌片超微粉（吉林康乃尔，国药准字 Z20050244）， 连二亚硫酸钠（Na2S2O4，Sigma），p-CaMKⅡ及CaMKⅡ抗体均购自美国CST公司，磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffer Saline，PBS）、高糖培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、双抗（HyClone）。 垂直电泳槽（Bio-rad），酶标仪（Biotek），凝胶成像系统（Biorad），高速冷冻离心机（Bio-rad）

1.2 细胞株 大鼠心肌细胞株H9c2（中山大学实验动物中心提供）。H9c2心肌细胞株来源于大鼠胚胎期心脏组织，在37℃、5%CO2的条件下，培养于含有10%胎牛血清或者10%含药血清的DMEM培养基中。

1.3 心肌细胞缺氧模型制备 采用加入Na2S2O4的方法模拟缺氧环境，取Na2S2O4粉末45.45 mg溶解于2.611 mL磷酸盐缓冲液中，充分溶解，配制成100 mmol/L的Na2S2O4溶液作为储备液，现配现用。将生长状态良好的H9c2细胞均匀种至60 mm细胞培养皿中，并设空白对照组正常培养，2 h后去掉培养基，收集细胞及其上清液，进行相关检测及研究。

1.4 细胞存活率检测 为了得到制备心肌缺氧模型的最佳浓度，我们采用MTT法对加入不同浓度连二亚硫酸钠后细胞存活率的影响进行比较。方案如下：将生长状态良好的H9c2细胞以5×104个/mL均匀种至96孔板，设置连二亚硫酸钠的最终浓度分别为0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 mmol/L，给药分组及剂量如表1所示，并设空白对照组正常培养。H9c2细胞37℃孵育24 h，每组 6 个副孔。 药物处理 24 h、48 h、72 h 后，每孔加入 5 g/L LMTT 溶液（PBS 配制）15 μL（溶液体积的 10%），37 ℃孵育 4 h，弃培养基，每孔加入 150 μL DMSO，振荡10 min，490 nm测定各孔OD值。以正常组OD值为对照，取6孔均值按公式计算细胞抑制率（%）＝（OD 对照组-OD 实验组）/（OD 对照组-OD 空白组）×100%。

1.5 丹蒌片含药血清的制备 选取雄性健康SD大鼠20只，随机分为丹蒌片给药（DLT）5 g/kg组10只，生理盐水组10只。取丹蒌片超微粉150 g溶解于100 mL生理盐水，搅拌均匀，充分溶解，配制成5 g/kg的丹蒌片混悬液。将SD大鼠称体质量，丹蒌片给药组按5 g/kg体质量灌胃丹蒌片混悬液，生理盐水组为空白对照组，不灌胃药液，只根据体质量灌胃生理盐水，连续灌胃10 d后取材，以7%水合氯醛于SD大鼠左下腹进行腹腔注射，麻醉大鼠，称量大鼠体质量，腹主动脉取血，将血液于常温静置2 h后，2 500 r/min离心5 min取上层血清，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，置于-80℃冰箱保存备用。

1.6 细胞分组与处理 通过实验确定最佳造模浓度后，进行进一步的机制研究。方案如下：将生长状态良好的H9c2细胞均匀种至60 mm细胞培养皿中，实验分组设置空白对照 （正常培养，无处理）组、模型（Na2S2O4）5 mmol/L 组、抑制剂（KN-93+Na2S2O4）组和给药（DLT+Na2S2O4）组，其中给药组用含 10%丹蒌片含药血清的高糖培养基培养24 h、抑制剂组用对应通路抑制剂处理2 h后，分别加入连二亚硫酸钠（终浓度5 mmol/L）缺氧2 h造模，每组设置平行3组，缺氧结束后去掉培养基，加入DMEM培养基正常培养进行复氧1 h。操作结束后进行相关检测及研究。

表2 实验分组及剂量

1.7 激光共聚焦检测钙离子浓度 用HBSS溶液稀释 1～5 mmol/L 的 Fluo 4-AM 母液，配制成 1～5 μmol/L的Fluo 4-AM工作液；取出预培养的细胞，除去培养基，使用HBSS溶液洗涤细胞3次；加入Fluo 4-AM工作液，溶液量以覆盖细胞为准；37℃细胞培养箱孵育10～60 min，除去Fluo 4-AM 工作液；用 HBSS溶液洗涤细胞3次，以充分去除残留的Fluo 4-AM工作液。然后加入HBSS溶液覆盖细胞；37℃培养箱孵育约20～30 min，以确保AM体在细胞内的完全去酯化作用；用激光共聚焦或荧光显微镜检测细胞，将细胞板中的盖玻片取出，放在激光扫描共聚焦显微镜载物台上，先用光学显微系统，初步调节焦平面，选择状态良好的心肌细胞，用氮氢离子激光预扫描，激发波长494 nm，发射波长516 nm，调节扫描范围、扫描参数扫描方式、光阑大小、扫描速度、采样点数、增益、焦平面使荧光图像清晰、层次明显。

1.8 蛋白免疫印迹法测定细胞裂解液中蛋白浓度将生长状态良好的H9c2细胞均匀种至六孔板中，药物作用后，弃培养基，用含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液冰上裂解细胞，提取细胞蛋白。BCA法测定细胞裂解液中蛋白浓度，计算上样体积。蛋白上样，用12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭1.5 h，加入相应稀释比例的第一抗体，4℃摇床孵育过夜。TBST洗膜后，更换二抗，室温摇床孵育1 h，TBST洗膜，ECL发光液处理，化学发光成像仪检测，分析相关蛋白的表达情况。

2 结 果

2.1 不同浓度下细胞形态学观察结果 倒置显微镜下观察发现，正常H9c2心肌细胞培养2～3 d后，胞体饱满富有立体感，呈长梭形，边界清晰，折光性好，细胞单层贴壁，互不重叠。加入Na2S2O4损伤后引起细胞形态学发生改变，在Na2S2O4（40 mmol/L）作用2 h后尤其明显，表现为缺氧模型组细胞膜皱缩，细胞体积缩小变圆，细胞无法正常贴壁，大面积脱落，成片漂浮于上清液中，胞体折光性下降，呈碎裂崩解坏死表现。其余给药浓度细胞形态变化不明显。见图1，图2。

图1 浓度梯度Na2S2O4造模2 h后（4倍）

图2 浓度梯度Na2S2O4造模2 h后（10倍）

2.2 各组细胞存活率检测结果 分别加入0.625～40 mmol/L Na2S2O4作用 H9c2 细胞 24、48、72 h 后，各组模型组与对照组相比细胞抑制率均显著上升 （P<0.01），并呈浓度依赖性升高。24 h 时，0.625～10 mmol/L Na2S2O4对细胞生长抑制作用梯度变化显著，而10～40 mmol/L Na2S2O4对细胞生长抑制作用变化不明显，几乎达到最大值 90%～95%；48 h时，0.625～2.5 mmol/L Na2S2O4对细胞生长抑制作用梯度变化显著，而2.5～40 mmol/L Na2S2O4对细胞生长抑制作用变化不明显，几乎达到最大值 86%～95%；72 h时，0.625、1.25 mmol/L Na2S2O4对细胞生长抑制作用梯度变化显著，而1.25～40 mmol/L Na2S2O4对细胞生长抑制作用变化不明显，几乎达到最大值86%～95%。由此可知，在24 h Na2S2O4（10 mmol/L）、48 h Na2S2O4（2.5 mmol/L）、72 h Na2S2O4（1.25 mmol/L）时可达到最大对细胞生长抑制作用（P<0.001）。从对细胞生长抑制作用效果好、重复性好、节省实验材料等角度综合考虑，故选择5 mmol/L Na2S2O4参与H9c2心肌细胞缺氧模型的建立。见表3、图3。

表3 Na2S2O4对心肌细胞抑制率影响时效、量效表

图3 不同浓度Na2S2O4对心肌细胞活性影响时效、量效图

2.3 激光共聚焦结果 结果如图4、5所示，未经连二亚硫酸钠处理的对照组心肌细胞，经Fluo-4染色后在激发光激发下发出较弱的绿色荧光，而经仅连二亚硫酸钠处理的模型组心肌细胞，经Fluo-4染色后在激发光激发下发出较强的绿色荧光，心肌细胞缺氧、复氧后，胞浆内钙离子浓度显著增高，说明形成心肌细胞钙超载损伤，与模型组相比，抑制剂组及丹蒌片组的荧光强度相对减弱，两组均能减轻H9c2细胞内钙超载的情况。

图4 各组心肌细胞钙离子浓度（Fluo-4染色，200倍）

图5 各组心肌细胞荧光强度值

2.4 蛋白免疫印迹结果 所示分组并干预后，结果见表4、图6，与对照组相比，模型组能升高p-CaMKⅡ的表达，证明模型组能够显著促进心肌细胞形成钙超载损伤，造模成功。而与模型组相比，给药组及抑制剂组均能显著降低p-CaMKⅡ的表达，证明给药组能够显著抑制心肌细胞钙超载。由此可知，通过调节p-CaMKⅡ蛋白的表达，丹蒌片能够抑制心肌细胞钙超载（P<0.001），减少心肌细胞损伤，发挥其对心肌缺血的保护作用。

表4 各组心肌细胞p-CaMKⅡ/CaMKⅡ灰度比值

图6 各组心肌细胞p-CaMKⅡ、CaMKⅡ蛋白电泳条带

3 讨 论

心肌遭受缺血再灌注后，参与细胞内钙循环的L-型电压依赖钙通道 （L-VDCC）、肌浆网钙ATP酶2a（SERCA2a）和受磷蛋白（PLB）、Ryanodine 受体 2（RyR2）、Na+/Ca2+交换体、Na+/H+交换体等多种蛋白功能异常，导致舒张期［Ca2+］i上升，钙瞬变幅度降低，细胞出现钙超载［7］。

肌浆网钙ATP酶2a（SERCA2a）是钙稳态的主要调节因子［8］。其功能是在舒张期重摄Ca2+进入肌浆网，以维持细胞内Ca2+稳态，调节心肌兴奋-收缩耦联［9］。受磷蛋白（PLB）是SERCA2a的主要调节因子，PLB和SERCA2a的相互作用，调节其对钙离子的亲和力。未磷酸化的PLB抑制SERCA2a钙离子的亲和力，PKA或CaMKⅡ磷酸化的PLB对SERCA2a的抑制作用减弱，增强肌浆网（SR）钙重摄取［10］。 在慢性缺氧导致的心衰大鼠中，CaMKⅡ合成可以代偿性增加，可一定程度上维持心功能。阻滞家兔心肌细胞中CaMKⅡ可以抑制异丙肾上腺素诱导产生的钙渗漏最终提高心肌细胞的收缩力。钙超载、酸中毒、活性氧（ROS）生成过多、炎症反应等多种机制可导致心脏功能失调，在器官水平上表现为心律失常、心肌梗死、心肌顿抑、无复流现象，其中钙超载作为最主要的心肌损伤机制而备受关注，针对钙超载机制与对抗措施的研究一直是关注热点［11-12］。多数研究者认为缺血再灌注过程中，Na+/Ca2+交换体活性增加是导致钙超载的主要原因［13-14］。CaMKⅡ作为Ca2+/CaM调节蛋白家族中的一个主要成员，其在细胞的病理生理过程中发挥着重要的生物学作用。

心肌缺血是多种心脏疾患的初始阶段。中医理论认为，“气虚血瘀”是心肌缺血再灌注损伤重要的中医病机。近年来，中药在心血管疾病的预防及治疗中占据重要地位，目前研究发现，中药对抗心肌缺血机制的研究角度主要有：抑制细胞凋亡、清除自由基、抑制钙超载、促进血管新生、抑制炎症损伤等［15］。丹蒌片是以中医经典名方为基础的纯植物药制剂。研究表明，丹蒌片能明显缩小冠心病痰瘀互结证大鼠的心肌梗死面积，降低心肌三酶活性，减轻心肌组织和心肌细胞病理损伤，对心肌缺血具有明显的保护作用，其机制可能与改善冠心病（痰瘀互结证）时血液高黏滞状态、血脂代谢紊乱以及抑制心肌细胞凋亡有关［16］。

本研究通过前期预实验，确定采用5 mmol/L Na2S2O4缺氧处理2 h以建立稳定的心肌细胞缺氧损伤模型，且能诱导H9c2细胞内钙离子平均荧光强度显著升高，细胞损伤程度适中。而抑制剂组能显著减轻H9c2细胞内钙超载，丹蒌片组能减轻H9c2细胞内钙超载。此外，在机制实验中，发现与模型组相比，丹蒌片给药组能显著降低p-CaMKⅡ的蛋白水平；提示丹蒌片通过调节p-CaMKⅡ信号通路，抑制钙超载，发挥其对心肌缺血的保护作用。Ca2+/CaM依赖的CaMKⅡ信号转导在心脏活动中具有重要作用，通过对CaMKⅡ活性及表达的抑制有可能不同程度地减少心肌缺血的形成，降低恶性室性心律失常的发生，甚至猝死。对CaMKⅡ信号转导途径的进一步研究不仅有助于探讨心肌缺血的始动因素及发生机理，也将为心肌缺血的防治提供新的思路，有着重要的理论意义与潜在的临床应用价值。