头穴透刺法对急性期脑出血大鼠脑组织Beclin1和BNIP3L蛋白表达的影响*

邹 伟 刘 鹏 于学平 戴晓红 于婷婷

（黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040）

脑出血是指脑实质发生的非外伤性的出血性病变，具有高发病率、高死亡率的特点。我国是脑出血髙发国家之一，严重影响人们的生命健康和生活质量［1］。脑出血后线粒体功能障碍会引起继发性脑损伤，导致细胞凋亡和坏死［2］。自噬也参与脑出血后的病理生理过程［3］，而线粒体自噬是一种靶向自噬，可以选择性去除受损线粒体，减少脑的继发性损伤。Beclin1作为自噬相关基因ATG6的哺乳动物同源体，主要参与自噬前体双层膜结构的形成，可以诱导自噬发生和自噬泡形成［4］，它与LC3-B一样均可作为自噬发生的标志性蛋白，Beclin1的表达水平能更好地反映自噬激活情况。BNIP3L参与介导线粒体自噬，在消除功能失调或过多的线粒体中扮演了重要的角色。目前头穴透刺法已成为中医治疗急性脑出血的重要治疗手段［5-6］，它是通过刺激脑不同的神经功能分区的方式，促进神经功能的恢复［7］。本研究应用自体血注射方法制备急性期脑出血模型，观察Beclin1和BNIP3L的表达情况，阐述头穴透刺法有可能通过影响急性期脑出血后的自噬水平而发挥神经保护作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择90只SD雄性大鼠，购自黑龙江中医药大学动物实验中心，其动物合格证号为SCXK（黑）2017-015，大鼠体质量 280～310 g。 饲养维持自然昼夜节律，自由饮食，室温控制在（25±3）℃，空气湿度为55%～60%。

1.2 试剂与仪器 脑立体定位（型号STW-3X，购于中国成都仪器厂），台式牙钻机（型号307-6，购于中国上海齿科医械厂），石蜡包埋机（型号EG1150H，购于德国莱卡公司），石蜡切片机（型号RM2235，购于德国莱卡公司），兔抗Beclin1抗体（型号bs-1353R，购于中国博奥森公司），兔抗BNIP3L抗体（型号12396，购于美国Cell Signaling Technology公司），二抗山羊抗兔IgG（型号 ab7090，购于英国 Abcam 公司），3-MA（型号189490，购于美国CALBIOCHEM公司），免疫组化检测试剂盒（型号PV-6001，购于北京中杉金桥生物技术公司），DBA显色增强剂（型号ZLI-9034Z，购于北京中杉金桥生物技术公司），PBS缓冲液 （型号AR0030，购于武汉博士德生物工程有限公司），显微摄影系统（型号BX43，购于日本OLYMPUS公司）。

1.3 分组与造模 大鼠随机分为5组（假手术、模型组、3-MA组、针刺组、针刺组+3-MA组），再分为6 h、1 d和7 d等3个时间亚组，每亚组6只。脑出血模型采取自体血注射的方法［8］。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（60 mg/kg）进行麻醉、剃毛、消毒后将其固定于脑立体定位上，正中切长约1 cm口，暴露前囟及冠状缝，取前囟点右旁开3.5 mm，后0.2 mm定点，用牙科钻钻直径为1.0 mm的圆孔［9］，距尾端3 cm处剪断鼠尾取血50 μL，将微量注射器固定于立体定位仪上进针约6 mm后，将血液50 μL以25 μL/min速度推进尾壳核，留针约2 min后出针。术后封闭、缝合、消毒。造模6 h后，采用Longa评分法［10］对各组大鼠进行神经功能评分。评分＞0者判定为出现神经功能缺损体征，且处死后取脑证实颅内血肿者视为造模成功。

1.4 干预方法 假手术组操作步骤如上，但不注血；模型组操作步骤如上；针刺组参照 《实验动物穴位图谱》选取百会穴和曲鬓穴，以0.35 mm×40 mm针灸针快速刺入百会穴帽状腱膜下，并向曲鬓穴透刺，进针深度大约1.5 cm。以150～180 r/min的速度进行捻转，每日1次，每次留针30 min，期间捻转刺激2次，每次持续5 min，每24小时进行1次，针刺操作均由同一针灸临床医师进行；3-MA组：在造模前30 min将自噬抑制剂3-MA［11］注射入侧脑室；针刺+3-MA组：在 3-MA组的基础上，采用同样的针刺方法。

1.5 标本采集与检测 1）神经功能评分。采用Bederson神经功能缺损体征评分［12］对大鼠进行神经功能测定。轻抓大鼠尾端，抬起高于桌面至20 cm，观察大鼠四肢活动情况。2）免疫组化。大鼠在相应时间点神经功能评估后，使用10%水合氯醛过量麻醉，以注血点为中心前后各旁开3 mm处冠状切开，将切下的6 mm厚度的大鼠脑组织块，石蜡包埋，切片机切成厚度4 μm的组织片后脱蜡至水。室温下在3%H2O2中孵育，PBS冲洗，切片入枸橼酸盐缓冲液。用PBS冲洗5 min，滴加一抗，过夜。滴加二抗，室温孵育30 min，PBS冲洗。DAB显色5～10 min。蒸馏水冲洗。苏木素复染1 min，水洗，脱水至二甲苯，中性树胶封片，应用病理图像分析系统对阳性细胞数的表达情况进行分析并拍照。

1.6 统计学处理 应用SPSS17统计软件。神经功能评分和免疫组化结果应用单因素方差分析结合Tukey检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组Bederson神经功能缺损体征评分比较 见表1。造模前各组无神经功能缺损，各项评分均为0，造模后1 d组大鼠神经功能缺损最重，7 d时神经功能缺损体征明显缓解。7 d时针刺组均较其他各组神经功能改善明显（P＜0.05）。

表1 各组Bederson神经功能缺损体征评分比较（分，±s）

表1 各组Bederson神经功能缺损体征评分比较（分，±s）

与 3-MA 组比较，*P＜0.05；与针刺组比较，△P＜0.05。 下同

组 别 n 7 d假手术组 6 0.00±0.00模型组 6 1.45±0.21 3-MA 组 6 1.63±0.15△6 h 1 d 0.00±0.00 0.00±0.00 2.28±0.21 2.52±0.19 2.53±0.34△ 2.83±0.21△针刺组 6 0.86±0.08*2.33±0.22 2.59±0.13针刺+3-MA 组 6 2.48±0.26 2.75±0.25 1.56±0.23

2.2 各组Beclin1和BINP3L在脑组织阳性细胞表达比较 见表2～表3，图1～图2。3-MA组阳性细胞数表达最少，针刺组表达最多（P＜0.05），针刺组与模型组差异有统计学意义（P＜0.05），针刺组与针刺+3-MA组差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

脑出血后的病理损害主要包括物理损伤和血肿引起的脑原发性损伤［13］及由线粒体功能障碍、小胶质细胞活化、神经递质、炎症介质的释放等所诱导的继发性脑损伤。继发性脑损害与脑出血后神经功能恶化和预后密切相关［2］。自噬在神经系统疾病中的作用是当今研究的热点。但是，自噬在脑损伤后起到有益还是有害的作用仍存在争议。线粒体自噬出现在蛛网膜下腔出血中，并起到保护神经组织免于蛛网膜下腔出血早期的凋亡、坏死性损伤［14］的作用。线粒体自噬是现在对细胞器选择性自噬研究中认识最清楚的一种。线粒体可以为细胞提供能量、参与细胞的凋亡，因此细胞对损伤线粒体的清除至关重要，而损伤线粒体的清除依赖于线粒体自噬。

表2 各组脑组织Beclin1阳性细胞数结果比较（±s）

表2 各组脑组织Beclin1阳性细胞数结果比较（±s）

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表3 各组脑组织BINP3L阳性细胞数结果比较（±s）

表3 各组脑组织BINP3L阳性细胞数结果比较（±s）

组 别 n 7 d假手术组 6 24.83±1.47模型组 6 51.67±1.27*3-MA 组 6 19.50±3.53 6 h 1 d 16.33±0.72 17.00±0.63 26.33±1.73*33.17±0.75*7.17±0.95 9.67±1.21△针刺组 6 52.67±1.24 33.00±0.89 43.50±0.84针刺+3-MA 组 6 22.33±0.52△ 28.50±0.55 35.83±0.96△

图1 7 d时各组大鼠脑组织Beclin1蛋白的表达（免疫组织化学法，400倍）

图2 7 d时各组大鼠脑组织BNIP3L蛋白的表达（免疫组织化学法，400倍）

Beclin1主要参与自噬前体双层膜结构的形成，其活性受PI3K的影响［13］，PI3K的催化亚基Vps34与Beclin1的特定结构域结合，导致磷脂酞肌醇磷酸化为磷脂酞肌醇-3-磷酸（PI3P），进一步促进自噬体双层膜结构的合成，同时Beclin1还可与UVRAG基因和Bcl-2共同形成复合物来共同调控自噬过程［14］。BNIP3L是介导线粒体自噬的重要途径之一。期初研究者把BNIP3L作为BH3-only蛋白研究其凋亡方面的作用，但发现其凋亡能力较弱［15］。Mclelland等的研究发现线粒体的程序性清除需要BNIP3L［16］。Novak的研究表明，BNIP3L有2个LIR序列，它可以通过LIR与LC3A等Atg8蛋白家族成员相互作用，进而诱导线粒体自噬。对BNIP3L同源蛋白BINP3的研究发现，其17与24位的色氨酸残基的磷酸化可促进其与LC3B的相互作用［17］。Maiuri等的研究发现BH3-only蛋白可以与Beclin1竞争结合Bcl-2，从而释放出游离的Beclin1，进而诱导自噬发生［18］。因此作为BH3-only蛋白的BNIP3L也可能通过这一机制诱导自噬。

《难经·四十七难》云“人头者，诸阳之会也”，因而针刺头部腧穴具有调节阴阳、疏通一身气血的作用，而“百会”透刺“曲鬓”可以贯穿督脉、足太阳膀胱经和足少阳胆经，可以达到一针横贯额、顶、颞三区的效果［19］。从20世纪90年代开始，头针治疗急性脑出血疗效引起关注，头穴透刺法是头针的重要组成部分。我们的研究团队在前期临床研究中证实，头穴透刺能明显降低急性脑出血患者神经功能缺损程度评分，总有效率达91.67%［20］。其他研究者通过在临床随机对照实验证实，头针利于脑出血患者的血肿吸收和改善临床神经功能缺损评分［21］。本次实验在自体血注入的急性脑出血模型基础上，采用神经功能评分法观察头穴透刺在脑出血急性期改善神经功能情况和免疫组化法对Beclin1和BNIP3L进行观察，结果显示假手术组，二者表达量均始终处于低水平表达状态，且各时间点表达量并无显著差异，而其他各组蛋白表达水平随脑出血时间而升高，至7 d时最高，相同时间点内，针刺组表达量最高，而3-MA组最低，3-MA+针刺组的表达水平则处于模型组和3-MA组之间。由此可见，头穴透刺法的刺激可以促使Beclin1和BNIP3L的表达量升高，使其对自噬体膜结构形成的催化作用增强，进而诱导自噬。3-MA抑制剂的使用则可以直接抑制PI3K活性，而阻碍自噬体的形成。Beclin1相对表达水平的降低则验证了3-MA对自噬的抑制作用，在针刺效应和3-MA抑制剂的联合作用下，蛋白的表达量仍高于单独3-MA抑制剂组，进一步证实了头穴透刺法可以通过对自噬的诱导来缓解3-MA对自噬的抑制作用，对脑出血大鼠脑组织细胞的具有保护作用，并且该结果与神经功能评分结果相一致。所以，头穴透刺法可以改善急性期脑出血大鼠的神经功能可能是通过调节Beclin1和BNIP3L的表达有关。