熊果酸对人非小细胞肺癌细胞系A549增殖、迁移、侵袭能力的影响及其机制探讨

李姝叶，毕小菁，王文军

(西南医科大学附属医院，四川泸州 646000)

肺癌是最常见的癌症，也是癌症死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的80%[1]。熊果酸(UA)是一种五环三萜类化合物，广泛存在于自然植物的茎皮、叶和果皮中，具有抗炎、抗氧化、抗血管生成及抗肿瘤等作用[2]。有研究[3]表明，UA可以调控肿瘤细胞的相关基因表达及调节肿瘤细胞的信号通路，从而产生抗肿瘤作用。Huang等[4]发现，UA可以明显抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。miRNA是一类非编码的小分子RNA，可以在转录后调控基因的表达，降解靶基因或抑制其翻译，从而影响肿瘤的发生和发展[5]。目前，有关UA抑制人肺癌细胞系A549的增殖、迁移、侵袭的作用机制尚不明确，且UA是否通过作用于miRNA从而抑制A549细胞的增殖、迁移、侵袭的相关研究甚少。2017年10月～2018年8月，我们观察了UA对A549细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 UA购自Sigma公司；A549细胞来源于西南医科大学中心实验室；miRNA-21 inhibitor、miRNA-21 mimic(RiboBio公司)；RPMI1640培养液(Hyclone公司)，新生小牛血清(四季青公司)，脂质体Lipofectamine2000、TRIzol试剂(Invitrogen公司)，CCK-8检测试剂盒(碧云天公司)，Transwell板、Matrigel胶(美国Corning公司)，RT-PCR试剂盒(大连TaKaRa公司)，PCR引物(武汉金开瑞公司)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(ASPEN公司)，抗GAPDH抗体、抗PTEN抗体及抗PI3K抗体(美国Abcam公司)，抗AKT抗体(美国CST公司)。

1.2 UA的IC50值计算及A549细胞中异常表达miRNA筛选 ①将A549细胞置入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养。取对数生长期细胞，用胰蛋白酶消化，配制成浓度为1×105/mL的细胞悬液接种于96孔板，每孔加100 μL，置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养24 h。分别加入0、5、10、20、30、40、50 μmol/L的UA，分别设置6个复孔，继续培养细胞24 h，所有孔中加入10 μL的CCK-8，于培养箱中孵育2 h，去除培养基，加入100 μL溶液，使用酶标仪测定450 nm处的OD值，实验重复3次。UA作用于A549细胞24 h后，UA的IC50值为42 μmol/L。②取对数生长期A549细胞5×107个，接种于培养基24 h，待细胞贴壁后加入42 μmol/L的UA继续培养24 h，同时选择不加UA的为对照；采用miRNeasy Mini Kit对两组细胞进行total RNA抽提，抽提所得total RNA经Agilent Bioanalyzer 2100电泳质检合格后备用，采用miRNA Complete Labeling and Hyb Kit对样品中的miRNA分子进行荧光标记及芯片杂交，芯片结果采用Agilent Microarray Scanner进行扫描，用Feature Extraction software 10.7.1.1读取数据，最后采用AgiMicroRna进行归一化处理，miRNA 芯片检测由上海伯豪生物技术有限公司完成。结果分析将改变大于2倍作为筛选异常表达miRNA的选择依据。UA诱导前后A549细胞中有34条表达改变大于2倍的miRNA，其中上调的miRNA有20条，下调的miRNA有14条，结合检出miRNA信号值及改变倍数综合考虑筛选miRNA-21做后续实验。

1.3 转染后A549细胞miR-21检测 采用PCR法。取对数生长期A549细胞并分为4组，a组转染miR-21 inhibitor，b组转染miR-21 mimic，c组转染miR-NC，d组不干预。根据脂质体Lipo 2000的说明书进行细胞的转染，分别用25 μL Opti-MEM无血清培养基将脂质体Lipo 2000、miR-21 inhibitor、miR-21 mimic及miR-NC稀释，室温孵育5 min后混匀，室温放置20 min。加入基础培养基继续培养。转染6 h后，细胞换完全培养基，继续于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养，24 h后，采用TRIzol法按照说明书提取细胞总RNA，逆转录合成cDNA，再按照荧光定量PCR试剂盒说明书进行扩增，按以下扩增程序反应：预变性、扩增40个循环、分析熔解曲线，每个样品均作3个复孔。以U6为内参照，以2-ΔΔCt代表目的基因的表达量。实验重复3次，取平均值。a、b、c、d组miR-21相对表达量分别为0.35±0.07、2.18±0.12、1.04±0.07、0.96±0.10，a、b组分别与c、d组比较，P均<0.05，证明转染成功。

1.4 UA对A549细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响观察 取对数生长期的A549细胞并分为A、B、C、D组，A、B组细胞分别转染miR-21 inhibitor及miR-21 mimic，24 h后除D组外其余各组均加入42 μmol/L UA继续培养并进行下述实验：①细胞增殖能力：上述4组细胞继续培养24 h后采用CCK-8法检测。使用酶标仪测定450 nm光吸收值，计算细胞增殖率，细胞增殖率=(实验组OD值-空白组OD值)/(对照组OD值-空白组OD值)×100%。实验重复3次，取平均值。②细胞迁移能力：上述4组细胞接种于6孔板中(每孔约5×105个)，用无菌枪头在孔内划5条平行线，PBS轻轻漂洗3次后加入培养基，置于37 ℃、5% CO2条件下继续培养，刚加入42 μmol/L UA时显微镜下拍照，记为0 h，继续培养24 h，拍照记为24 h。实验重复3次，结果取平均值。③细胞侵袭能力：采用Transwell实验。将matrigel和培养基以1∶3的比例稀释，取50 μL加入Transwell小室中干燥备用。分别取200 μL(105个/mL)上述4组细胞悬液放入Transwell小室中。将小室放入含培养基的24孔板中置于37 ℃、5%CO2条件下培养48 h，将小室取出，用棉签将上室中的胶和细胞擦除干净，结晶紫染色10 min，洗去表面的结晶紫，于倒置显微镜下计数迁移至微孔膜下层的细胞数，拍照。实验重复3次，取平均值。

1.5 UA对A549细胞PTEN、PI3K、AKT表达的影响观察 ①PTEN、PI3K、AKT mRNA：采用荧光定量PCR法检测。收集“1.4”中4组细胞，采用“1.3”中荧光定量PCR法检测各组细胞PTEN、PI3K、AKT mRNA。②PTEN、PI3K、AKT蛋白：采用Western blotting法。收集“1.4”中4组细胞，按照细胞总蛋白提取试剂盒步骤提取细胞蛋白，采用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度。根据测得浓度取相应体积样品至每孔40 μg蛋白，100 ℃沸水浴5 min，按浓缩胶80 V、分离胶120 V进行恒压电泳，按300 mA恒流转膜，转膜时间根据目的蛋白分子量大小调整。将转好的膜加入封闭液室温封闭1 h。加入已稀释好的一抗4 ℃过夜，用TBST洗3次，加入稀释好的二抗，室温孵育30 min，ECL发光并拍照。将胶片进行扫描存档，AlphaEaseFC软件处理系统分析目标带的光密度值。

2 结果

2.1 各组细胞增殖率、24 h划痕相对宽度、穿膜个数比较 细胞增殖率、24 h划痕相对宽度、穿膜个数比较见表1。

表1 各组细胞增殖率、24 h划痕相对宽度、穿膜个数比较

注：与C组比较，*P<0.05。

2.2 各组细胞PTEN、PI3K、AKT蛋白和mRNA比较 细胞PTEN、PI3K、AKT蛋白和mRNA比较见表2。

3 讨论

肺癌是当今世界最常见的恶性肿瘤之一，据美国癌症协会统计，最常见的癌症死亡原因是肺癌，肺癌按组织病理学可分为NSCLC和小细胞肺癌，其中NSCLC约占80%，主要包括腺癌、鳞状上皮细胞癌、大细胞癌以及一些发病率较低的肺癌[6]。手术、化疗、放疗、分子靶向治疗、免疫治疗、中药治疗是目前临床上治疗NSCLC的主要方法，但因为大部分患者确诊时已处于病程中晚期，丧失了最佳的手术时机,且化疗药不良反应大，故NSCLC患者的5年生存率也只有大约65%[7,8]。A549细胞为NSCLC的主要类型，因此寻找能够抑制A549细胞增殖、迁移、侵袭及促进A549细胞凋亡的新方法具有重大意义。

表2 各组细胞PTEN、PI3K、AKT蛋白和mRNA比较

注：与C组比较，*P<0.05。

UA是一种五环三萜类化合物，具有抗炎、抗氧化、肝保护、抗血管、抗肿瘤生成等作用[9～12]。UA有抗肿瘤作用，可用于乳腺癌、白血病、前列腺癌、黑色素瘤、子宫内膜癌、肺癌等治疗中[13]。Hsu等[14]研究表明，UA可以抑制肺癌A549细胞增殖，促进其凋亡，是最有前途的抗肺癌药物之一。本研究显示，UA能抑制肺癌A549细胞的增殖、迁移和侵袭。

众所周知，miRNA-21通过调控细胞增殖、转移、血管生成、抗凋亡等多种分子机制，在肿瘤发展中发挥着关键作用[15]。各种研究都观察到miRNA-21在肺癌患者中的表达异常[16]。PI3K/AKT信号通路在控制细胞存活、促进细胞增殖、抑制细胞凋亡等方面具有重要作用[17]。PTEN是目前已知的第一种抑制肿瘤活性的磷酸酶[18]。PTEN/PI3K/AKT信号通路是包括骨肉瘤在内的许多实体癌发生过程中的主要调控因子，PTEN/PI3K/AKT蛋白已被发现在多种癌症中异常表达[19,20]。Li等[21]发现，miR-21通过下调PTEN以及激活PI3K/AKT通路参与EGFR-TKI在NSCLC中的获得性耐药。Zhang等[22]认为,下调miR-21的表达后，肿瘤抑制因子PTEN表达增加，抑制了NSCLC的增殖和侵袭。故可以猜想miRNA-21调控细胞的作用可能与PTEN/PI3K/AKT信号通路有关。

UA可以通过上调或者下调miRNA的表达从而调控细胞功能，Lu等[23]发现UA通过抑制miRNA-21/PTEN/Akt/mTOR途径上调自噬，减轻糖尿病系膜细胞损伤。Jiang等[24]报道UA诱导大鼠原发性血管平滑肌细胞的抗增殖作用与抑制miRNA-21后引发PTEN/PI3K的变化有关。Wu等[25]研究表明，UA通过上调PTEN基因表达和PI3K/Akt通路失活从而诱导K562细胞凋亡。本研究显示，UA作用下肺癌A549细胞miR-21相对表达量下降，PTEN表达升高，PI3K、AKT表达降低，由此我们可以猜测，UA能抑制肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭的作用机制可能是通过下调miRNA-21作用于PTEN/PI3K/AKT通路来实现的。为了验证我们的猜测，我们在肺癌A549细胞中转染了miRNA-21 inhibitor，转染成功后肺癌A549细胞的miRNA-21 表达明显下降，在下调miRNA-21表达后，UA抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭作用增强，PTEN的表达增加，并且抑制了PI3K/AKT的表达，而转染miRNA-21 mimic后的肺癌A549细胞的miRNA-21 表达明显增多，在上调miRNA-21表达后，UA抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭作用减弱，PTEN的表达减少，PI3K/AKT表达增加。

总之，UA能抑制肺癌A549细胞的增殖、迁移和侵袭，其作用机制可能是通过下调miRNA-21作用于PTEN/PI3K/AKT通路来实现的，这为以后UA的基础研究、临床研究及应用提供了理论基础。