SAL与EGCG联合应用对人胃癌细胞株SGC-7901增殖、凋亡的影响及其机制

米志宽，隋丽欣，赵菊梅

(1延安大学医学院，陕西延安 716000；2延安市肿瘤防治研究重点研究室)

目前，我国胃癌筛查模式不完善，且不同的人群对筛查的认知、态度不一，同时因人口基数大、老龄化趋势明显，胃癌发病率及病死率依然很高[1]。盐霉素(SAL)具有抗肿瘤作用，并靶向作用于肿瘤干细胞，诱导细胞自噬，促进凋亡[2,3]。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是绿茶中最主要的活性成分，其具有降低氧自由基、脂质过氧化物及调节致癌物的代谢、抗病毒、广谱抗菌的特性[4～7]。SAL和EGCG虽然各自有不同的抗肿瘤作用，但目前尚未见两者联合作用于胃癌细胞中的相关报道。本研究观察了SAL联合EGCG对人胃癌细胞株SGC-7901增殖、凋亡的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 胃癌细胞、试剂及仪器 SGC-7901细胞(武汉博士德公司)；RPMI1640培养基、胎牛血清、兔抗人bcl-2、bax抗体、羊抗兔二抗(武汉博士德公司)，EGCG、MTT、AO/EB凋亡试剂盒(美国Sigma公司)，β-actin、bcl-2、bax引物(由上海生工设计合成)；全波长酶标仪(美国Molecular Devices公司)，荧光显微镜(日本Nikon E400)，凝胶成像系统GENE(英国Syngene公司)。

1.2 SGC-7901细胞培养 SGC-7901细胞采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI1640培养液培养，置于37 ℃、5%CO2培养箱中。

1.3 SAL、EGCG单独及联合干预24、48、72 h后SGC-7901细胞增殖抑制率测算 采用常规胰酶消化，收集对数生长期的SGC-7901细胞，以每孔3×103个细胞接种于96孔培养板中，培养24 h，后分组。联合组：加入5、10、20、40 mg/L的EGCG及2 μmol/L的SAL；SAL组：加入1、2、4、8 μmol/L的SAL;EGCG组：加入5、10、20、40 mg/L的EGCG；对照组：无药物，只加培养液。每组均设置5个平行孔，温育24、48、72 h。每孔加入浓度为5 mg/mL的MTT溶液20 μL，培养4 h。吸净上清液，每孔加DMSO 150 μL，振荡10 min，使用酶标仪测定波长为490 nm处的吸光度值(OD值)，对照组调零，各组细胞增殖能力以OD值表示。细胞增殖抑制率=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%，设定联合组、SAL组、EGCG组为实验组。以上实验结果重复3次后取平均值。

1.4 SAL、EGCG单独及联合干预48 h后SGC-7901细胞荧光染色情况观察 采用常规胰酶消化，取对数生长期的SGC-7901细胞，以2×105/mL接种于内有干净无菌盖玻片的6孔板中，培养24 h后分组。联合组：加入2 μmol/L的SAL和10 mg/L的EGCG；SAL组：加入2 μmol/L的SAL；EGCG组：加入10 mg/L的EGCG；对照组：无药物，仅加培养基。培养48 h后弃培养液，PBS洗涤3次，按照试剂盒说明书进行AO/EB荧光染色，夹出盖玻片置于载玻片上，荧光显微镜观察拍照。正常细胞生长状态良好，细胞核形态结构正常，呈绿色荧光；凋亡细胞细胞核固缩，呈红色荧光；死亡细胞细胞核形态结构正常，呈橘红色荧光。

1.5 SAL、EGCG单独及联合干预48 h后SGC-7901细胞bax、bcl-2 mRNA检测 采用RT-PCR法检测。收集联合组、SAL组、EGCG组、对照组处理48 h的细胞，分组情况与“1.4”相同，按照TRIzol试剂盒说明书操作提取总RNA，取2 μL进行反转录。取扩增产物5 μL，用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，用凝胶全自动成像系统拍照，以β-actin为内参照，计算bax、bcl-2条带灰度的比值。

2 结果

2.1 各组不同时点细胞增殖抑制率比较 结果见表1。

表1 各组不同时点细胞增殖抑制率比较

注：与对照组比较，※P<0.05；与同组上一浓度比较，#P<0.05；与同组前一时间点比较，△P<0.05。

2.2 各组细胞荧光染色情况比较 联合组可见绿色荧光细胞数目减少，红色荧光凋亡细胞和橘红色死亡细胞明显增多；单药组可见细胞数减少，出现少量细胞核固缩的红色荧光凋亡细胞和个别细胞核形态结构正常的橘红色死亡细胞；对照组细胞质丰富，细胞核大小均一，呈绿色荧光(见图1)。

注：A为对照组;B为SAL组;C为EGCG组;D为联合组。

图1SGC-7901细胞核染色结果(AO/EB荧光染色，×200)

2.3 各组细胞bax、bcl-2 mRNA相对表达量比较 结果见表2。

表2 各组细胞bax、bcl-2 mRNA相对表达量比较

注：与对照组比较，※P<0.05。

3 讨论

胃癌是严重威胁我国人民健康的疾病之一，其较高的复发率仍是治疗的难题。胃中分化腺癌的恶性程度比胃低分化腺癌低，但其病情发展较快，因此胃中分化腺癌的治疗亦比较困难。早期胃中分化腺癌的治疗以手术切除为主，中晚期胃中分化腺癌的治疗主张多种方法综合进行。化疗是进展期胃癌的主要治疗手段，主要采用细胞毒药物联合方案化疗。目前，国际上无一致公认的进展期胃癌标准化疗方案。因此，改善现有的用药策略以及寻找更为有效的联合化疗方案是胃癌的重要研究方向。

羧基聚醚类型抗生素SAL不仅对胰腺癌[8]、乳腺癌[9]、白血病[10]等多种肿瘤干细胞有抑制作用，且不易出现耐药性[11]，能够增强17-AAG[12]、顺铂[13]、白藜芦醇[14]等药物抗肿瘤效应。研究[15]证实，SAL具有抗癌作用，其作用机制的主要信号通路如下：①抑制Wnt/β-catenin信号通路相关靶基因表达；②增加Akt/PKB通路活性；③抑制mTOR信号通路转导；④使细胞内活性氧累积。EGCG抗肿瘤作用与促进自噬、生长抑制、周期停滞、诱导凋亡、抗血管生成、抑制侵袭等有关[16]。研究[17]发现，SAL能减少阿霉素、顺铂、氟尿嘧啶、吉西他滨、吉非替尼、长春新碱等药物的耐药性。绿茶中的EGCG具有广泛的积极生物活性，在心血管、癌症、神经退行性疾病、代谢综合征和2型糖尿病等严重慢性疾病中均可发挥保护作用[18]。在抗癌方面，EGCG对非小细胞肺癌[19]、黑色素瘤[20]、胰腺癌[21]等恶性肿瘤中具有一定促凋亡、抑增殖效果。长期单一使用化疗药易使肿瘤细胞对化学治疗药物敏感性降低，几种药物的联合应用可以克服肿瘤细胞对某一类药物的耐药。本研究显示，SAL、EGCG单药随着药物浓度的增加和作用时间的延长，均能呈剂量时间依赖性抑制SGC-7901细胞增殖，联合用药时抑制细胞增殖效果更显著，联合用药时EGCG能减少SAL的用量，增强SGC-7901细胞对SAL敏感度；从荧光染色结果可见，对照组均为均匀绿色荧光、形态正常的细胞，在EGCG或SAL处理48 h后，SGC-7901细胞形态有改变，并出现少量红色荧光凋亡细胞，在EGCG和SAL联合48h后发现SGC-7901细胞减少，红色荧光凋亡细胞比例更明显，提示SAL、EGCG均能抑制SGC-7901细胞增殖，并诱导凋亡，两者联合效果更佳。

凋亡通过对一系列相关基因的激活、表达以及调控等作用，如bcl-2家族、caspase家族、癌基因、抑癌基因等，为更好地适应生存环境，而在机体中散在的、逐个地从死亡和消失的一种细胞程序性死亡。bcl-2、bax是bcl-2家族中重要的凋亡调节因子。bcl-2抑制细胞凋亡与凋亡促进基因bax相拮抗，共同决定细胞的凋亡[22]。Gao等[23]学者发现，SAL能通过上调凋亡基因bax、细胞色素C、凋亡肽酶激活因子1表达，下调bcl-2表达来调控凋亡。本研究显示，联合用药可使SGC-7901细胞中bax表达升高，bcl-2表达下降，联合用药使两种蛋白变化更明显，提示SAL和EGCG联合用药可增强SGC-7901细胞凋亡的敏感性，其发生机制可能与下调bcl-2蛋白表达、上调bax蛋白表达有关。

总之，SAL、EGCG均能抑制SGC-7901细胞增殖，并诱导凋亡，两者联合效果更佳，其机制可能与降低bax表达及升高bcl-2表达有关。SAL与EGCG的联合应用可增强药物的敏感性，可能是治疗胃癌的一种有效的途径。