己酮可可碱灌胃对大鼠酒精性肝炎的治疗作用及其机制探讨

雷佳，王飞勇，田晓娟

(1巴彦淖尔市医院，内蒙古巴彦淖尔 015000；2包头医学院第一附属医院)

基金项目：包头医学院科学研究基金青苗计划(H0315)。

通信作者：田晓娟(E-mail: txcookie@163.com)

酒精性肝炎(AH)是酒精性肝病(ALD)类型之一，属于肝脏疾患早中期阶段，其发病机制复杂多样，目前机制尚不完全明确。AH发病率为10%～35%，30 d及1年病死率分别为15%、39%。重症酒精性肝炎属于AH特殊表现形式，其1年病死率可达60%[1～3]。AH发病比例高，目前认为在此期进行有效的干预手段如戒酒、合理膳食、药物支持治疗等，往往可阻止及逆转肝脏和机体的继续损害[4]；其中药物治疗还可对部分嗜酒并且戒酒依从性差AH患者有良好的治疗作用，可抑制肝脏和机体进一步损害，减慢肝脏疾病进展，延长患者AH生存期。己酮可可碱(PTX)具有抗炎、抗肝纤维化、调节免疫等作用，是治疗AH的一线药物[5～8]，但目前PTX的具体作用机制在国内外尚不明确。本研究观察了PTX灌胃对大鼠AH的治疗作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲料 8周龄SPF级Wistar雄性大鼠30只，体质量(180±40)g，购自内蒙古医科大学动物实验中心[动物许可证编号SCXK(蒙2015-0001)]；饲养环境：温度(22±2)℃，湿度50%～60%；基础饲料(由内蒙古大学实验动物中心提供)，高脂饲料(基础饲料88%+猪油10%+胆固醇2%)。

1.2 PTX、白酒、试剂、仪器 PTX(纯度>99%，购自北京索莱宝生物公司)；市售北京红星二锅头56°白酒；ALT、AST购于罗氏诊断产品(上海)有限公司，10%中性缓冲甲醛固定液购于北京九州柏林生物科技有限公司，一抗过氧化物酶体增殖物受体α(PPAR-α)、NF-κP65及二抗快捷型酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物均购于Protech公司， DAB试剂盒购于上海迈新生物有限公司；罗氏501全自动生化仪，病理切片机(型号LEICA RM2245)购于-上海芯超生物公司。

1.3 实验动物分组、AH模型制备及PTX灌胃 按照前期预实验及参考相关文献后，将大鼠随机分为A、B、C各10只。A、B组给予高脂饲料， C组给予普通饲料。A、B组大鼠每日给予阶梯式改良白酒灌胃法创建AH模型[9～11]，即1～3周灌胃30%乙醇5.0 g/(kg·d)，4～6 周灌胃40%乙醇6.0 g/(kg·d)，7～9周灌胃50%乙醇7.0g/(kg·d)，10～12周灌胃60%乙醇8.0 g/(kg·d),每日9︰00灌胃，1次/d；第9周始A组大鼠于每日15︰00灌胃9 mg/(kg·d)的PTX,B、C组灌胃等量生理盐水，持续至12周末。

1.4 大鼠一般情况观察 一般情况包含每天灌胃前后观察大鼠精神状态、步态、毛色、粪便情况,用电子秤测量大鼠体质量。

1.5 大鼠血清AST、AT检测 12周最后一次给药后，30只大鼠禁食12 h，后依次按照组别腹腔注射10%水合氯醛0.35 g/kg麻醉处死，腹主动脉取血2 mL于抗凝管内，离心后采用全自动生化仪检测血清AST、ALT，操作严格按照试剂盒操作说明进行，用国际临床化学联合会(IFCC)酶学参考法测量血清ALT，用谷草转氨酶比色法测量血清AST。

1.6 大鼠肝脏组织观察 取血后按组别处死大鼠，电子秤大鼠净重称重完毕后，迅速分离肝脏组织并将肝脏组织称重，肉眼观察肝脏组织。取肝左叶及右叶各切取2块肝脏组织，10%甲醛固定，石蜡包埋并切片，常规HE染色，镜下观察，参照2014年AHHS病理[9]评分标准及ALD诊疗指南[10]。

1.7 大鼠肝脏组织PPAR-α、NF-κB蛋白检测 将肝脏置于-80 ℃保存，取100 mg肝组织制备组织匀浆；提取组织蛋白及定量，再行SDS-PAGE(浓度10%)分离胶溶液，将处理好的样品按照预定的顺序加入浓缩胶的上样孔内，每张胶上加入10 μL的样品量；电泳分离，转移至PVD膜；将PPAR-α及NF-κB一抗加入不同标记的PVDF膜上，将样本膜正面，置于暗室，经X线曝光后，显影液将胶片显影，置入清水中短暂漂洗后，定影，晾干保存，扫描图像，用Image-Pro Plus Analysis Soft ware系统将目标蛋白灰度图像转化为数据分析。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况比较 C组：大鼠行为敏捷，食欲好，毛发光滑，有光泽，大便性状正常。B组：初始期灌入酒精后，5～20 min后出现醉酒症状，表现为步态不稳、不喜动、嗜睡等；2～4 h后，逐渐好转；4周后出现酒精耐受情况，表现为醉酒状态时间变短，部分甚至不表现醉酒症状；随着酒精量不断蓄积，在9周时大鼠出现毛发脱落，不喜吃食，大便为稀便；12周末更为严重，表现为毛发无光泽且粗糙，个别大鼠有脱毛后有皮肤裸露现象，厌食，大便干燥无光泽，呈浅灰色。A组：前9周表现与B组大鼠相同，9周后大鼠逐步出现食欲较前增加，大便成型，掉毛现象较前好转，体质量出现增长且缓慢。各组大鼠不同时点体质量比较见表1。

表1 各组不同时点大鼠体质量比较

2.2 各组血清ALT、AST水平比较 结果见表2。

表2 各组血清ALT、AST水平比较

注：与C组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05。

2.3 各组肝脏组织肉眼观、镜下观比较 肉眼观：C组肝脏质地细腻，色泽红润，无黄色颗粒附着，无肝淤血； B组肝脏质脆，易碎，色泽暗红，且外表部分附有黄色油腻颗粒，肝淤血较重；A组仅有极少数肝脏有黄色颗粒附着，淤血情况较实验组轻。镜下观：C组无肝损伤；B组有肝脏损伤，且肝脏损伤程度最重；A组有肝脏损伤，但损伤程度较B组轻。

2.4 各组肝脏PPAR-α、NF-κB蛋白相对表达量比较 肝脏组织PPAR-α、NF-κB P65相对表达量比较见表3。

表3 各组肝脏组织PPAR-α、NF-κB P65蛋白相对表达量比较

注：与C组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05。

3 讨论

ALD为常见的肝脏疾患之一，是由于慢性长期或一次性大量摄入酒精后，引起肝脏生理病理损害。随着我国经济及社会发展，ALD成为继乙型病毒性肝炎后第二大肝脏疾患，目前共分为五个阶段[11～13]，AH属于ALD的重要阶段，在此阶段的诊治，会影响ALD疾病的演变及预后。目前，戒酒是最基础的治疗，终末期ALD时行肝脏移植在一定程度上可延长患者生存期，但由于肝源匮乏及经济负担重，故此治疗很大程度局限性。所以药物治疗尤为重要，故探讨PTX对AH的治疗机制，对治疗AH有着现实意义。

PTX是国内外药物治疗AH中一线治疗药物之一，属非选择性磷酸二酯酶抑制药，具有抗炎、抗免疫、抗内毒素的作用，在多器官、多系统均有作用，被广泛应用于临床。PTX以前主要应用于心脑血管疾病治疗，现在用于AH的治疗中，并写入了指南及教科书中[14,15]。目前研究[16,17]发现，PTX治疗严重AH患者在一定程度上可减少肝肾综合征的发生，明显降低其病死率。本研究显示，C组大鼠无机体及肝损害表现；A、B组大鼠机体一般情况、体质量不及C组，且肝脏ALT、AST指标高，肝脏均有不同程度的脂肪浸润及炎性损伤；其中B组机体一般情况最差，且肝脏ALT、AST指标及病理炎症程度最重；A组药物干预后，以上指标有了一定改善，但其改善程度不及C组。

PPAR-α是一种配体活化的转录因子，属于PPARs超家族一员，高表达于脂肪酸B氧化水平高的器官—肝脏。在肝脏中可被激活上调。PPAR-α上调一方面可参与调节脂肪酸氧化和运输，在线粒体及β氧化活跃的肝脏中水平较多通过促进脂肪分解[18,19]，另一方面可起到抗氧化及免疫作用，用来改善AH中的肝脏脂肪代谢紊乱，免疫应答功能异常等作用。NF-κB是可引起肝脏炎症、纤维化、肝细胞坏死及凋亡等作用的转录因子细胞，其下调可抑制TNF-α激活，使表达降低起到抗炎作用。由于NF-κB功能多样，可作用于趋化因子、生长因子、细胞黏附因子及早期反应的蛋白质分子基因的转录，而参与炎症和免疫反应，故NF-κB在许多疾病中均有表达。NF-κB P65是NF-κb家族中的一员，其活性较强可使肝细胞缺血损伤加重，并促进肝细胞凋亡和肝细胞肿瘤形成。在肝脏中NF-κB P65活性较强[20]，其激活会对AH的细胞凋亡调控机制起重要作用，可产生更多炎症因子，参与肝纤维化的形成，进一步加重肝脏损害，加速了AH病程的发展及演变。PPAR-α和NF-κB P65在众多领域都有研究，因其抗炎、抗氧化、抗肝纤维化、调节脂肪代谢等作用，故与AH密切相关。目前在国内外报道中，PTX在治疗AH时，对肝脏保护机制的相关研究较少，所以PPAR-α和NF-κB P65机制研究对今后AH的临床治疗十分重要。本研究显示，与C组比较，A、B组PPAR-α蛋白相对表达量降低，NF-κB P65蛋白相对表达量升高；与B组比较，A组PPAR-α蛋白相对表达量升高，NF-κB P65蛋白相对表达量降低。由此可推测，PPAR-α、NF-κB P65蛋白水平的增减与肝脏损害程度有关， PTX可能通过对PPAR-α和NF-κB P65水平的调控来治疗AH。

总之，PTX可治疗大鼠AH，其机制可能与上调PPAR-α表达和下调NF-κB P65表达有关。