二甲双胍对人肝癌细胞系HepG2增殖、迁移能力的影响及其机制探讨

刘力，范文芳，贺晓旭，邓祖亮，何松，彭钊，王文婷

(1湘南学院附属医院，湖南郴州 423000；2湘南学院附属医院)

原发性肝癌(HCC)是我国常见的消化道恶性肿瘤之一，每年可明确诊断的病例约40万人，达到全球范围新确诊病例的50%左右，病死率在全球高达第2位，每年死亡人数超过30万[1]。研究[2,3]发现，上皮间质转化(EMT)被认为是肿瘤浸润转移的重要机制之一，并被证实逆转EMT可显著降低肿瘤细胞的侵袭、转移能力。课题组前期研究证实，人肝癌细胞系HepG2使用生长抑素干预后可逆转EMT发生，从而降低肝癌细胞侵袭和转移能力[4]。二甲双胍(Met)是治疗2型糖尿病的一线用药，能显著降低2型糖尿病合并肝癌等肿瘤发病的概率[5]，具有多种抗肿瘤作用，包括抑制LKB1-AMPK-mTOR途径、诱导细胞周期停滞及降低循环中胰岛素、IGFs水平和抑制肿瘤新生血管的生成、炎症反应、氧自由基的生成、肿瘤干细胞增殖等。EMT作为肿瘤浸润转移的重要机制，与Met之间的关系在国内外鲜有报道。本研究观察了Met对HepG2细胞增殖、迁移能力的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌细胞系HepG2购自中国科学院上海细胞生物所；盐酸二甲双胍购自贵州圣济堂制药有限公司；DMEM培养基、RPMI1640购自Hyclone公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)购自Bioswamp公司；胎牛血清、F12 K购自Gibco公司；胰蛋白酶及PBS购自Bioswamp公司；Protein G Magnetic Beads购自Cell Signaling公司；Transwell系统购自美国Corning公司；蛋白质Marker购自Thermo公司；十二烷基硫酸钠(SDS)、TEMED、过硫酸胺购自Sigma公司；PVDF转移膜、化学发光试剂购自Millipore公司；Tween-20购自Amresco公司；RIPA(强)组织细胞快速裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、PBS磷酸盐缓冲液购自Bioswamp公司；兔抗人E-cadherin、Vimentin抗体购自Bioswamp公司。

1.2 HepG2细胞培养、分组及二甲双胍的应用 将冻存的HepG2细胞从液氮罐中取出，置于DMEM培养基中(内含10%FBS+100 U/mL青-链霉素)，于37 ℃、5%CO2细胞培养箱内培养24 h，等待细胞生长，达到80%融合时进行传代。提取传6代的对数生长期细胞使用0.25%胰蛋白酶消化，配制成单细胞悬液，调整细胞密度至1×104/mL，以每孔100 μL接种于96孔板中培养24 h。将细胞分为A、B、C、D、E组，各组设6个平行孔，A、B、C、D组分别加入1、5、10、50 mmol/L的二甲双胍各200 μL，E组给予等体积培养基，继续培养24 h。

1.3 HepG2细胞增殖能力观察 采用MTT法。收集对数生长期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔180 μL，每种细胞每块板接种3个同样的孔作为复孔，1×103～5×103个细胞/孔，以200 μL培养液做空白对照，37 ℃培养过夜；各组药物处理后继续培养48 h；取出不同分组的细胞培养板，每孔加20 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h；吸掉上清，每孔加入150 μL的DMSO溶解液，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值(OD值)，计算细胞存活率，细胞存活率=试验组OD值/对照组OD值×100%(A、B、C、D组为试验组，E组为对照组)。

1.4 HepG2细胞迁移能力观察 采用Transwell小室法。选取100 μL单细胞悬液，调整细胞密度为5×104/mL，予以接种于Transwell上室中，各组药物处理后在Transwell下室加入DMEM高糖培养基(含10%FBS)600 μL。继续培养24 h，然后倒置小室将滤膜下表面朝上，4%多聚甲醛固定(室温，15 min)，0.1%结晶紫染色(15 min)，进行封片。在200倍显微镜下，随机取5个不同视野进行计数，穿过滤膜的细胞数即为跨膜细胞数，每组平行设3个滤膜。

1.5 HepG2细胞E-cadherin、Vimentin检测 采用Western blotting法。各组药物处理48 h后，分别提取各组细胞总蛋白，各蛋白定量采用BCA法进行。取40 μg蛋白进行电泳，转膜，使用5%BSA溶液封闭2 h，一抗在4 ℃环境中孵育过夜：E-cadherin(1∶1 000)、Vimentin(1∶1 000)、β-actin(1∶500)，TBST洗膜10 min，共4次；相应二抗室温孵育2 h，TBST洗膜10 min，同样为4次。加入ECL发光剂，化学发光成像系统自动提取结果，计算两种蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞存活率、跨膜细胞数比较 结果见表1。

表1 各组细胞存活率、跨膜细胞数比较

注：与E组比较，*P<0.05；与A组比较，#P<0.05；与B组比较，☆P<0.05；与C组比较，ΔP<0.05。

2.2 各组E-cadherin、Vimentin相对表达量比较 结果见表2。

表2 各组E-cadherin、Vimentin相对表达量比较

注：与E组比较，*P<0.05；与A组比较，#P<0.05；与B组比较，☆P<0.05；与C组比较，ΔP<0.05。

3 讨论

我国原发性肝癌发病率高，每年新发病例约占全球病例总数的50%[6]，且有逐年升高趋势，严重威胁人们身体健康和生命安全，因此肝癌的防治是现今社会非常重要的任务。随着医学的发展及国民经济的增长，以外科手术为主的治疗模式已逐渐转变为结合放化疗、射频、微波消融、TACE、靶向、免疫等多种治疗手段的综合治疗模式[7]。使肝癌患者接受了更加规范化、综合性的治疗，预后也逐步改善，但仍有50%以上的患者在治疗5年内出现复发、转移，是肝癌患者治疗失败和死亡的主要原因。如何有效地预防及治疗复发转移，是改善肝癌患者远期疗效的关键，也是目前研究的热点和难点。

大量临床流行病学研究[8,9]发现，2型糖尿病患者原发性肝癌的发病率显著增高。Met为治疗2型糖尿病的常用药物，报道称其具有潜在抗肝癌作用。研究[10,11]显示，2型糖尿病合并肝癌患者长期口服Met后能抑制肝癌细胞的增殖，起到降低肝癌发生的风险。Met抗肝癌的机制主要有以下几方面：①抑制LKB1-AMPK-mTOR 途径[12,13]；②诱导细胞周期停滞[14,15]；③降低循环中胰岛素、IGFs的水平[16]；④抑制肿瘤新生血管的生成和炎症反应[17,18]；⑤抑制氧自由基的生成[19]；⑥抑制肿瘤干细胞增殖[20]。EMT是指在某些因素作用下，上皮细胞转变为有间质细胞表型的过程[21]。改变肿瘤细胞的连接及极性，使得肿瘤细胞间黏附性减弱、运动性增强，从而诱导肿瘤细胞侵袭及转移，并被认为其重要机制之一[22]。在原发性肝癌的病理生理进程中起非常重要的作用，发生EMT可以促进肝纤维化及癌变发展，并且是促进转移的关键因素。由于人肝癌细胞系HepG2组织类型为肝母细胞瘤，适合用于肝细胞代谢方面的研究，故本实验选择该细胞。在MTT实验中，随着Met浓度增加，细胞存活率降低；而在Transwell小室法实验中可见，随着Met浓度增加，跨膜细胞数越少；通过这两部分实验可以表明Met能抑制肝癌细胞增殖及迁移能力，且呈浓度依赖性。

为明确Met与肝癌细胞EMT之间的关系，本研究检测了药物干预后细胞内重要蛋白的表达，包括EMT代表性上皮细胞标志物E-cadherin及间质细胞标志物Vimentin。结果发现，各药物组E-cadherin表达量均高于E组，且随着Met浓度升高其表达量升高；而Vimentin表达量降低，同样与浓度呈依赖性。可以得知，Met具有逆转肝癌细胞EMT的作用，并且与Met的浓度有关。这也为Met能抑制肝癌细胞侵袭转移能力提供了一个理论基础。但肿瘤细胞侵袭转移过程为多因素、多过程及多环节，其具体的机制还有待研究。

总之，不同浓度Met均能抑制人肝癌细胞系HepG2的侵袭及转移，且呈浓度依赖性，其机制可能为逆转EMT的发生有关。