吡咯替尼对SNU-1胃癌细胞增殖能力及不同类型胃癌组织中钙黏蛋白S100A10表达的影响

王兴国，贾 娇，马 林

(1.榆林市第二医院普通外科,陕西 榆林 719000;2.榆林市第二医院消化内科,陕西 榆林 719000;3.宝鸡市中医医院普通外科,陕西 宝鸡 721000)

据国家癌症中心2015年相关数据显示，胃癌发病率仅次于肺癌，在我国恶性肿瘤中发病率居第二位[1-3]。80%的新病例在诊断开始时已发展到中晚期。与日韩早期胃癌诊断率较高、欧美胃癌发病率较低相比，我国在胃癌防治方面仍面临非常严峻的形势[4-6]。我国胃癌诊治水平参差不齐，进一步加大了胃癌的治疗难度。胃癌发病机制与多因素、多阶段、多基因参与有关，是一个比较复杂的发展过程，而且会常伴随凋亡蛋白、抑癌基因失活以及癌基因激活等多方面因素。有研究[7-8]显示，在对晚期HER-2阳性乳腺癌患者Ⅱ期治疗中，应用吡咯替尼辅助化疗能够提升患者的远期生存率。为了了解吡咯替尼对胃癌的治疗效果，本研究通过细胞体外培养实验方法，探讨吡咯替尼对人胃癌细胞增殖能力及不同类型胃癌组织中钙黏蛋白S100A10表达的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料 选取购自上海拜力生物科技有限公司的人胃癌SNU-1细胞株、北京索来宝生物科技有限公司的RPMI 1640培养基，北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司的Hy Clone胎牛血清，磷酸盐缓冲液PBS，实验室留存的正常胃黏膜、非典型增生组织、高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌、淋巴结转移癌组织，每种组织样本数量20个，以及购自江苏恒瑞医药股份有限公司的吡咯替尼。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组：阴性对照组，加培养基和细胞，不加药物干预；空白组，加等量培养基，不加细胞；吡咯替尼药物浓度分别为25、50、100 μmol/ml组，每组设置5个复孔。

1.2.2 细胞培养：将SNU-1胃癌细胞株复苏之后，加入含有10%的新生小牛血清RPMI 1640培养液在5% CO2培养箱中静置培养，使用0.25%胰酶消化传代，每5 d进行1次传代，长到对数生长期。

1.2.3 MTT法测定胃癌细胞增殖情况：用移液管吸取对数生长期的人胃癌SNU-1细胞，加入含有10%胎牛血清的培养基，约高于培养皿底面3～4 mm，制成单细胞悬液，调整密度为2×105个/ml。使用加样器以每孔100 μl将细胞悬液接种于96孔板内(空白孔不加)，以保证每孔有2×104个细胞，将接种好的细胞置于37 ℃的5% CO2培养箱中，培养24 h待细胞贴壁后取出，药物组分别加入不同浓度的吡咯替尼，每个孔20 μl，阴性孔和空白孔加入等量的培养基，在37 ℃、5% CO2中培养，记录培养后24、36、72 h的细胞生长抑制率[9-10]。

1.2.4 癌组织培养与吡咯替尼干预：分别取正常胃黏膜、非典型增生组织、高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌、淋巴结转移癌组织，每种组织样本数量20个，将样本进行标签标记之后，应用实验清洗液将样本清洗3次后，放置在无菌培养皿之中，应用无菌眼科剪将组织剪成(1～2)mm×(1～2)mm×(1～2)mm的小块，再应用培养液清洗3次，各组织小块之间相距0.5 cm为宜。盖好培养板盖，将培养板翻转，倒置于37 ℃ 5% CO2培养箱中，3 h后，待组织块边缘微干涸，然后将培养板取出，缓缓向培养板中加入培养液，平放入培养箱培养。每24 h更换一次培养液，观察不同组织的生长情况，待有细胞从组织之中爬出，呈现半透明状态，则培养存活，如果组织变黑，没有细胞爬出则可认定组织培养死亡，并将死亡的组织挑出。

1.2.5 免疫组织化学法检测不同类型组织中钙黏蛋白S100A10表达情况：应用免疫组织化学法，测定正常胃黏膜、非典型增生组织、高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌、淋巴结转移癌组织中钙黏蛋白S100A10表达情况，具体步骤依照钙黏蛋白S100A10试剂盒进行。并选取高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌、淋巴结转移癌每种20个存活组织进行实验，应用100 μmol/ml浓度吡咯替尼分别加入到不同的胃癌组织中，在干预48 h之后，继续应用免疫组织化学法测定组织中钙黏蛋白S100A10表达情况。

1.3 评价标准 组织中的蛋白表达结果依照阳性细胞数比例和染色强度进行综合计分。阳性细胞数：≤10%计1分，11%～50%计2分，>50%计3分；染色强度：棕褐色计3分，黄色计2分，无色计1分；随后将阳性细胞数分值乘以染色强度分值，1分为阴性(-)，2～4分为阳性(+)，≥5分为强阳性()。

2 结 果

2.1 不同浓度吡咯替尼对SNU-1胃癌细胞抑制率的影响 不同浓度吡咯替尼对SNU-1胃癌细胞在24、36、48 h的生长抑制作用逐渐增强，组间对比差异具有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 不同浓度吡咯替尼对SNU-1胃癌细胞抑制率的影响(%)

2.2 不同类型胃癌组织中钙黏蛋白S100A10免疫组化染色表达 应用免疫组化染色检验正常胃黏膜、非典型增生、胃癌和淋巴结转移癌组织中S100A10蛋白表达情况，S100A10蛋白主要位于细胞浆内，而且表达情况也有所不同，见图1。

A：正常胃黏膜组；B：非典型增生组；C：高分化腺癌组；

2.3 不同类型胃癌组织S100A10蛋白阳性表达率比较 正常胃黏膜中S100A10蛋白表阳性表达率为5.00%，非典型增生组织为20.00%，高分化腺癌为40.00%，中分化腺癌为55.00%，低分化腺癌为65.00%，淋巴结转移为65.00%，组间对比，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表2。

表2 不同类型胃癌组织中S100A10蛋白阳性表达率比较[个(%)]

2.4 不同类型胃癌组织吡咯替尼干预后钙黏蛋白S100A10阳性表达的变化 由于正常胃黏膜和非典型增生组织中S100A10阳性率比较低，因此选取高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌和淋巴结转移胃癌组织应用100 μmol/ml剂量吡咯替尼进行干预，吡咯替尼干预前后中分化腺癌和低分化腺癌组织中S100A10阳性表达对比差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 不同类型胃癌组织吡咯替尼干预后钙黏蛋白S100A10阳性表达的变化 (个)

3 讨 论

胃癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率均居世界前列。胃癌大多是通过胃炎-萎缩-肠化-不典型增生的过程演变而来，其中萎缩、肠化和不典型增生是胃癌的癌前病变[11-13]。本病早期无明显症状，导致大多数患者发现本病已发展到晚期，无法通过手术治愈。因此寻找能够判定患者早期胃癌的相关指标，探讨不同药物对胃癌细胞的影响效果，对胃癌的临床治疗具有重要意义。吡咯替尼是马来酸盐类药物，上市剂型主要是片剂，规格为160 mg/片，当前被应用到许多癌症的辅助治疗中。相关研究[14-15]发现，吡咯替尼是新型的 EGFR 家族不可逆酪氨酸激酶抑制剂,同时具有抗 EGFR/HER-1、HER-2 以及 HER-4 的活性。S100A10蛋白，即p11蛋白，是钙结合蛋白家族S100成员，S100A10蛋白由两个同分异构单位α和β共同构成异型二聚体或同型二聚体，大多情况下是以同型二聚体存在的，参与细胞的内外物质运转、胞吐和胞吞。有研究[16]显示，S100家族成员在肿瘤的发展发生中具有重要作用，而且家族多个成员在肿瘤组织的异常表达和肿瘤的发生、转移、浸润具有明显关系。因此本文主要探讨吡咯替尼对人胃癌细胞增殖能力及不同类型胃癌组织中钙黏蛋白S100A10表达的影响，希望能够为临床胃癌的治疗与疾病控制提供参考。

本研究结果表明，不同浓度吡咯替尼对SNU-1胃癌细胞在24、36、48 h的生长抑制作用增强，组间对比差异具有统计学意义，由此证明，吡咯替尼能够抑制胃癌细胞增殖，而且浓度越高效果越好，但是应用到临床治疗中还需要将不良反应等多种参照加入找出适合的药物剂量。相关研究[17]发现，应用吡咯替尼对晚期乳腺癌患者的治疗中，能够提升患者10%的5年生存率，具有重要临床应用价值，与本研究将吡咯替尼应用到胃癌的治疗中；应用免疫组化染色检验正常胃黏膜、非典型增生、胃癌和淋巴结转移癌组织中S100A10蛋白表达情况发现，S100A10蛋白主要位于细胞浆内，而且表达情况也有所不同；正常胃黏膜中S100A10蛋白表阳性表达率为5.00%，非典型增生组织为20.00%，高分化腺癌为40.00%，中分化腺癌为55.00%，低分化腺癌为65.00%，淋巴结转移为65.00%，组间对比差异有统计学意义。相关研究[18]发现，Annexin A2和S100A10能够产生相互作用，加速组织型纤溶酶原激活物介导纤溶酶产生，能够进一步激活蛋白酶，从而活化基质金属蛋白酶，促进肿瘤的转移和浸润。还有研究[19-20]发现，S100A10蛋白在淋巴结转移组织和胃癌组织的阳性表达率明显高于正常胃黏膜组织。因此本研究应用S100A10蛋白阳性表达来作为药物干预的评判标准；由于正常胃黏膜和非典型增生组织中S100A10阳性率比较低，因此选取高分化腺癌、中分化腺癌、低分化腺癌和淋巴结转移胃癌组织应用100 μmol/ml剂量吡咯替尼进行干预，吡咯替尼干预前后中分化腺癌和低分化腺癌组织中S100A10阳性率影响对比差异有统计学意义，由此证明，吡咯替尼对不同类型胃癌组织中S100A10蛋白表达具有一定抑制作用，特别是对于低分化和中分化胃癌组织，因此吡咯替尼可能对胃癌细胞的增殖与转移有抑制作用。但是本研究样本量过少，而且胃癌存在遗传学个体差异，所以临床应用之前仍然需要扩大样本进行实验研究，从而确保临床治疗的确切性。

综上所述，吡咯替尼对于人胃癌细胞增殖能力具有抑制作用，不同类型胃癌组织中钙黏蛋白S100A10表达有所不同，随着胃癌细胞的增殖，钙黏蛋白S100A10表达的阳性表达增高，吡咯替尼对于不同胃组织钙黏蛋白S100A10表达具有一定影响，因此吡咯替尼对胃癌可能具有一定治疗作用，可为胃癌的临床治疗提供参考。