火鸡疱疹病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

白银荣，张志飞，李雪松，刘芹防，陈鸿军，杨健美，李泽君，滕巧泱，张七斤

（1.内蒙古农业大学，呼和浩特 010018；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

火鸡疱疹病毒（Herpesvirus of turkey，HVT）是Ⅲ型马立克氏病病毒（Marek’s disease virus，MDV），属于疱疹病毒科、疱疹病毒甲亚科、马立克氏病毒属，为线性双链DNA病毒[1]。HVT是细胞结合性疱疹病毒，能够感染鸡胚成纤维细胞（chicken embryo fibroblast，CEF）并产生病变。鸡感染HVT后可终生携带，但是无致病性[2-3]。自20世纪70年代HVT被发现以来，一直作为活疫苗预防MDV感染，效果良好[4]。目前，HVT活疫苗已广泛地应用于1日龄雏鸡来预防马立克氏病[5-6]。

在体外，通常采用蚀斑技术对HVT疫苗免疫效力和增殖情况进行检测，但该方法准确性低，重复性差，易受许多因素的影响，而且操作繁琐，周期长，很难应用于大量样品的快速检测。本研究拟建立一种快速、简便、敏感、特异且准确的HVT荧光定量PCR检测方法，为及时检测HVT的病毒含量提供有效的手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒毒株、SPF鸡胚和CEF细胞 火鸡疱疹病毒FC-126疫苗冻干毒购自哈尔滨兽药厂；鸭瘟病毒（Duck plague virus，DPV）、传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV）、鹅细小病毒（Goose parvovirus，GPV）、血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4，FADV4）和FADV8均由本实验室提供；SPF鸡胚由北京梅里亚维通实验动物技术有限公司提供；采用9～11日龄SPF鸡胚制备原代细胞。

1.1.2 载体和受体菌 pMD19-T载体购自TaKaRa公司；大肠杆菌DH5α购自北京天根生物技术有限公司。

1.2 主要试剂和仪器 2×HieffTMPCR Master Mix购自 圣生物公司；DNA分子量标准（DL2000）购自TaKaRa公司；Ezup柱式病毒DNA抽提试剂盒购自生工生物工程股份有限公司；DMEM购自Hyclone公司；0.25%胰酶购自Gibco公司；胎牛血清购自Biosun公司；质粒小量提取试剂盒和PCR产物回收试剂盒购自Axygen公司；荧光定量PCR仪购自Eppendorf公司；紫外分光光度计购自Thermo公司；UV-2000型紫外分析割胶仪购自上海天能科技有限公司。

1.3 引物设计 根据NCBI登录的HVT FC-126毒株（AF281966）的sorf1基因序列，应用Beacon Designer 8设计特异性引物和探针（表1）。引物和探针由上海华津生物科技有限公司合成。

表1 引物和探针信息Table 1 The sequences of primers and probe

1.4 标准质粒的构建 在CEF上扩增病毒，病变达到80%～90%时，收集细胞并提取总DNA，具体方法参照Ezup柱式病毒DNA抽提试剂盒说明书。以提取的HVT基因组DNA为模板，PCR扩增sorf1基因。PCR反应体系：ddH2O 19 μL、2×HieffTMPCR Master Mix 25 μL、上游引物（10 μmol/L）2 μL、下游引物（10 μmol/L）2 μL、DNA模板2 μL。反应条件：95℃预变性3 min；94℃变性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸10 s，进行30个循环；72℃再延伸7 min。PCR扩增产物经纯化后，连接于pMD19-T载体。PCR检测为阳性的菌液送上海擎科生物公司测序。将测序正确的菌液进行PCR扩增并提取质粒，命名为p-sorf1。测定质粒浓度后用公式计算质粒拷贝数，10倍梯度稀释后作为标准品，即浓度分别为1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100copies/μL。

1.5 反应条件优化及标准曲线建立 在同一浓度模板的反应体系中，采用正交试验法对引物浓度进行优化。以1.4中经10倍梯度稀释的重组质粒标准品作为模板，利用优化的反应条件，在Mastercycler®RealPlex2荧光定量PCR仪上进行检测，获得模板拷贝数与临界循环数（cycle threshold，Ct）的标准曲线。

1.6 敏感性 将重组质粒进行10倍梯度稀释，分别以1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100copies/μL为模板，利用优化的反应条件进行荧光定量PCR检测。通过不同浓度标准品的Ct值，判定该方法所能检测的最小DNA拷贝数。以梯度稀释的质粒为模板，HVT-F和HVT-R为引物（表1），采用常规PCR方法来扩增HVT，用1%琼脂糖电泳鉴定PCR产物。

1.7 特异性 分别以DPV、ILTV、GPV、FADV4和FADV8的基因组DNA为模板，设空白对照，按优化的反应体系进行荧光定量PCR，检测该方法的特异性。

1.8 重复性试验 选取1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106copies/μL 5个不同浓度的标准品，进行组间和组内重复性检测，每个样品重复3次，计算变异系数。

1.9 临床样品检测 对本实验室采集的82份样品按1.4中方法提取基因组DNA，分别使用建立的HVT荧光定量PCR方法以及常规PCR方法来进行检测。

2 结果

2.1 标准品制备及鉴定 普通PCR可扩增出约85 bp的特异性条带，与目的片段大小一致（图1）。将该片段连接于pMD19-T载体，获得重组质粒p-sorf1，测序结果显示与原序列完全一致。提取的质粒DNA经紫外分光光度计测定浓度为62 ng/μL，OD260/OD280比值为1.98，符合纯度要求。经公式：Copy Number = ( amount× 6.022×1023) /(length×1×109×660)，计算出阳性重组质粒的拷贝数为2.0×1010copies/μL。

2.2 荧光定量PCR标准品的制备及标准曲线的建立 经优化后最终确定的PCR反应体系：ddH2O 6.4 μL、2×Premix ExTaq10 μL、上游引物（10 μmol/L）0.6 μL、下游引物（10 μmol/L）0.6 μL、探针（10 μmol/L）0.4 μL、模板2 μL。最佳反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火34 s，40个循环。将p-sorf1质粒梯度稀释后制备标准品，稀释浓度分别为1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102copies/μL。以各个浓度的质粒作为模板，经qPCR扩增，获得标准曲线方程：y=-3.42logx+41.21（图2），相关系数R2为0.999，说明建立的qPCR方法标准曲线的线性关系良好；扩增效率为107%，产物的Ct值与浓度呈良好的线性关系。

图1 sorf1基因的PCR扩增结果Fig.1 PCR results of sorf1 gene

图2 荧光定量PCR检测的标准曲线Fig.2 Standard curve of fl uorescence quantitative PCR

2.3 敏感性分析 将质粒进行10倍梯度稀释，分别以1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100copies/μL为模板，利用优化的反应条件进行荧光定量PCR检测，结果为阳性的最高稀释度的质粒浓度为1×102copies/μL（图3），而普通PCR检测的灵敏度为1×103copies/μL（图4），可见，荧光定量PCR的敏感性是普通PCR的10倍。2.5 特异性分析 检测结果表明，应用建立的TaqMan荧光定量PCR进行检测，仅HVT有特异性扩增曲线，而DPV、ILTV、GPV、FAdV-4和FAdV-8均为阴性（图5），表明该方法具有良好的特异性。

图3 荧光定量PCR的敏感性检测Fig.3 Sensitivity of fl uorescence quantitative PCR

图4 常规PCR检测结果Fig.4 Result of the conventional PCR

图5 荧光定量PCR检测方法的特异性Fig.5 Specifi city of fl uorescence quantitative PCR

2.6 重复性分析 将重组质粒分别进行10倍梯度稀释，选取浓度为1×1010、1×109、1×108、1×107、1×106copies/μL的重组质粒作为模板，验证建立的荧光定量PCR方法的重复性。由表2可知，组间和组内变异系数均小于1%，表明本研究所建立的荧光定量PCR检测方法重复性良好。

表2 荧光定量PCR检测方法的重复性Table2 Repeatability of fl uorescence quantitative PCR

2.7 临床样品检测 分别使用建立的HVT荧光定量PCR方法和普通PCR方法对本实验制备的82份HVT病毒样品进行检测。以p-sorf1质粒标准品为阳性对照，超纯水为空白对照。检测结果显示，荧光定量PCR检测出43份阳性样品，普通PCR检测出30份阳性样品，进一步证实建立的荧光定量PCR方法较普通PCR更敏感。

3 讨论

HVT与马立克氏病毒在遗传学和血清学上具有相关性，一直作为活疫苗用于预防马立克氏病[4,7]。同时，HVT作为载体携带外源保护性抗原具有许多优势：对鸡和其他动物无致病性，较为安全；接种后鸡体能产生长达数周的病毒血症，从而刺激机体产生较高的抗体水平；HVT疫苗生产成本低，可冻干，贮存和运输方便[8-9]。国内外对以HVT为载体的禽病重组疫苗已开展了大量的研究，如传染性法氏囊病（infectious bursal disease，IBD），新城疫（newcastle disease，ND）和禽流感（avian influenza，AI）等[10]。快速、准确有效地判断HVT在细胞和机体内的复制情况，是HVT载体疫苗研究的重要基础。

本研究通过条件优化，最终建立了较为理想的HVT荧光定量PCR检测方法。标准曲线的相关系数为0.999，线性关系良好，扩增效率为107%（扩增效率应为0.8～1.2，以接近1为最佳）。该方法可特异性检测到HVT，灵敏度较普通PCR提高1个数量级，提高了检测病原的敏感性。检测临床样品时，建立的HVT荧光定量PCR检测方法较普通PCR的方法的检测率提高了16%。结果表明，本研究所建立的HVT荧光定量PCR检测方法，具有较好的准确性、特异性和敏感性，为评估HVT免疫情况及其新型疫苗的后续研发奠定了基础。