小反刍兽疫病毒分子生物学及其疫苗研究进展

董丹丹，刘 腾，缪秋红，朱 杰，张 莉,2，殷冬冬，唐井玉，李传峰，陈宗艳，刘光清

（1.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241；2.安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036）

小反刍兽疫（Peste des petits ruminants，PPR），又名羊瘟、伪牛瘟等，是由小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）引起的一种急性病毒性传染病，主要感染绵羊和山羊[1]，其特征是发病急剧，眼鼻分泌物增加，口腔糜烂，腹泻和肺炎等。目前PPR在许多国家呈地方性流行并造成了严重的经济损失。

1 小反刍兽疫概况

1942年，小反刍兽疫首次发现于西非的科特迪瓦[2]，由于其临床症状和病理变化与牛瘟相似，所以起初被认为是牛瘟的变种。直到1979年，Gibbs等[2]证实PPRV是副黏病毒科、麻疹病毒属中不同于牛瘟病毒的新成员。2007年中国西藏阿里地区首次出现PPR病例，随后又有几次地方性流行。

PPRV只有一个血清型，根据N基因序列可将其分为4个谱系，即谱系Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ[3]。谱系Ⅰ和Ⅱ主要从西非一些国家分离得到，而西非正是PPRV的发源地。谱系Ⅲ仅限于非洲东部和中东地区，谱系Ⅳ被认为是由新出现病毒组成的新谱系。有研究发现，谱系Ⅳ正逐渐取代其他谱系，成为PPR流行国家的优势谱系。

2 小反刍兽疫病原学

2.1 PPRV基因组结构 PPRV为副黏病毒科、麻疹病毒属成员。病毒粒子呈多形性，多为粗糙的球形，平均直径为400～500 nm。PPRV的基因组由1条单股负链RNA分子组成，大小为15 948 nt[4]，含有6个转录单位，编码6个结构蛋白和2个非结构蛋白：核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素蛋白（HN）和大蛋白（L），以及2个非结构蛋白C和V（图1）。

2.2 PPRV基因组长度“六碱基规则” 研究表明麻疹病毒属所有成员都有一个典型特征：基因组长度是6的倍数。PPRV基因组同样符合“六碱基规则”。有一种解释为每个N蛋白能与6个核苷酸结合，病毒基因组符合6的倍数能够保证N蛋白与病毒RNA的完全结合[6]。最近研究表明PPRV服从六碱基率，但也具有一定的灵活性[7]。PPRV通过一个未知的机制进行转录复制，使得基因组长度能够适应一些偏差，如+1、+2和-1。

2.3 PPRV编码蛋白的功能

2.3.1 核衣壳蛋白（N） N蛋白是主要的结构蛋白之一，特别是在不分段的负链RNA病毒中。N蛋白虽然不能诱导机体产生针对病毒的保护性免疫，但是含量最多，免疫原性最高，因此在临床诊断中被广泛的使用。PPRV N蛋白的ORF起始于核苷酸位点108（UAC），终止于1685位点（AUU），经翻译产生的N蛋白大小为58 kDa。最近Dechamma等[8]确定了PPRV N蛋白的最高免疫活性区（氨基酸位点452～472）。

图1 小反刍兽疫病毒结构示意图[5]Fig. 1 Schematic diagram of peste des petits ruminants virus (PPRV) structure[5]

根据PPRV N基因序列相似性将N蛋白划分为四个区域。区域1（氨基酸位点为1～220）相当保守，在整个谱系中具有75%～83%的一致性，而区域2（氨基酸位点为122～145）仅有40%的一致性。区域3（氨基酸位点为146～398)和区域4（氨基酸位点为421～525）的保守性分别最高和最低。Choi等[9]研究表明PPRV N蛋白的区域1和区域2 比区域3、区域4具有更高的免疫原性，这一结果与麻疹病毒属其他病毒（人麻疹病毒和牛瘟病毒）结果相符。此外，针对区域1的体液免疫反应发生要早于区域2。现在N蛋白被认为是在麻疹病毒属中主要的交叉反应性抗原。

N蛋白在多个阶段影响着副粘病毒科病毒的生活史：与M蛋白一起促进病毒的组装，促使基因组RNA壳体化，在病毒的复制和转录过程中参与P-L聚合酶复合物的形成。Servan等[10]通过沉默N基因发现N蛋白在PPRV的复制过程中发挥着重要的作用。他们进一步揭示，抑制N蛋白的表达也会降低M蛋白的产量。Keita等[11]进一步缩小N基因的活性位点为5'RRWYYDRNUGGUUYGRG3'基序（R代表A/G，W代表A/U，Y代表C/U，D代表G/A，N代表任何碱基），沉默该基序后会抑制PPRV、RPV和MV的N基因转录。具体来说，这段基序（RINWFEN）在PPRV中位于N蛋白的143～149氨基酸位点。中间部分（NWF）在所有毒株中都是保守的。

在麻疹病毒中，N蛋白可分为两部分，即Ncore和Ntial。Ncore为420个氨基酸，在麻疹病毒和PPRV中都非常保守，可能反映了Ncore在核酸衣壳组装过程中至关重要。Ntial是一个大小为12 kDa的C端区域（CTD)，在麻疹病毒和PPRV中保守性相对较低。CTD的488～499位点氨基酸主要负责N蛋白与其他病毒蛋白的互作[12]。CTD暴露于N蛋白的表面并且很容易经胰酶消化后清除。在麻疹病毒中，尽管Ntial被移除，Ncore仍然具有在麻疹病毒中生成核衣壳样结构的能力[13]。Karlin等[12]发现将麻疹病毒228位丝氨酸和229位点的亮氨酸突变后，N蛋白的自我交联能力受损且不能包装RNA，表明MV N蛋白可能通过自我交联产生参与RNA结合的结构。麻疹病毒N蛋白可以和宿主调节蛋白（Hsp72、IRF3和细胞表面受体）相互作用，表明了N蛋白在病毒复制和细胞嗜性中的作用[14]。

N蛋白和P蛋白结合到病毒基因组的前导和尾随部分起始病毒基因组组装，随后进行N-N交联和N-RNA相互作用。目前已经证明了两个区域，其中一个位于N端（1～120），另一个位于中间区域（146～241），它们均负责PPRV的N-N自我组装。研究人员进一步证实N蛋白121～145氨基酸的短片段对核衣壳结构的稳定性起重要作用，这个区域在麻疹病毒属中非常保守[15]。

2.3.2 磷蛋白（P） 在PPRV中1807～3333氨基酸编码P蛋白，翻译产生分子大小约为60 kDa的蛋白，但是从感染细胞中提取的P蛋白经SDS-PAGE鉴定的分子大小为79 kDa[16]。麻疹病毒属中P蛋白的大小在72～86 kDa间的变化主要是由它的酸性碱基及翻译后磷酸化引起的[16]。Netphos 2.0预测有5个潜在的磷酸化位点[17]，并且这些位点在麻疹病毒属中都很保守。在PPRV中4个氨基酸位点同样也是保守的，它们分别是151、307、361、470，但是348位点处苏氨酸代替了丝氨酸。P蛋白磷酸化功能的重要性尚不完全明确。

P蛋白是L-聚合酶复合物的重要组成部分，并且可能是麻疹病毒跨物种致病性的关键因素[18]。尽管P蛋白在麻疹病毒复制中发挥重要作用，但其在PPRV复制和致病性方面的作用仍有待进一步研究。

2.3.3 基质蛋白（M） M蛋白开放阅读框的核苷酸位点在3438～4442nt，被翻译为含有335个氨基酸的蛋白，预测分子量大小为37.8 kDa。M蛋白也与N蛋白及H与F蛋白的胞质尾端相互作用[19]。最近在同科病毒的尼帕病毒中发现了一种名为FMYL基序，该基序位于50～53位点，并对M蛋白定位于细胞膜及出芽过程至关重要[20]。在M基因与F基因连接处存在一个长为1080 nt的非保守UTR，该序列包含M基因的末端和F基因的起始端且富含GC。这个区域的功能相关性还未被解释清楚，但是Takeda等[21]的研究表明MV M蛋白的长链3'UTR具有上调M蛋白的功能，而F基因的长链5'UTR可以降低F蛋白的表达量。

2.3.4 融合蛋白（F） F基因在PPRV毒株中非常保守，编码由546个氨基酸组成的富含GC的蛋白，预测分子量大小为59.137 kDa。这种高水平的序列保守性可以解释麻疹病毒属中不同成员之间存在的广泛交叉保护，例如针对RPV的疫苗可以使动物产生抗PPRV的免疫力。副粘病毒科间F基因序列同源性也解释了常见的融合性质和基于F蛋白的保守生物学活性。在麻疹病毒中，F蛋白在H蛋白的帮助下介导病毒囊膜在细胞表面与胞膜融合，从而使病毒进入哺乳动物细胞，随后病毒基因组获得了进入宿主细胞的通道[22]。

无活性的前体F0是决定副粘病毒毒力的关键分子之一，主要依赖于裂解位点的氨基酸序列及胞内蛋白酶裂解F蛋白的能力。尽管这种裂解能力对于病毒的组装并不重要，但它是病毒感染性和发病机理的先决条件[23]。F0转录后蛋白酶裂解产生两个通过二硫键相连的活性亚基F1和F2。F0蛋白序列分析表明麻疹病毒中除了两个可变疏水区外具有很强的保守性。N端第一个区域负责将蛋白质带到粗面内质网上进行翻译，而第二个区域（C端）与蛋白锚定在膜上有关。后者被认为停留在细胞膜的细胞质一侧，并与M蛋白互作从而促进病毒出芽，因为此区域突变后导致病毒产量下降[24]。这些区域在所有的PPRV毒株中都具有高度的保守性。在副粘病毒中，F1的膜锚定亚基包含4个保守基序：N端融合肽（FP）、HR1、HR2和跨膜区（TM）。在PPRV中，HR1-HR2复合物的3D结构显示HR2和HR1异二聚体覆盖了HR1三聚体的内核，从而形成了一个六螺旋束。FP区域锚定在膜上，HR区域的降解导致胞膜与病毒囊膜的距离拉近，从而促使它们的膜融合[25]。因为如SV5、NDV和PPRV的大多数副粘病毒都携带这些HR结构，推测它们含有共同的融合机制。在副粘病毒中F蛋白包含1个亮氨酸拉链基序，在PPRV中位于459～480氨基酸位点并且较为保守。该基序通过未知的机制负责F蛋白的寡聚化和融合功能[26]。

和所有膜相关蛋白一样，F蛋白进行潜在的糖基化。在这个转录后修饰过程中，添加寡糖侧链对于F蛋白运输至细胞表面并保持其膜融合功能及完整性至关重要。所有麻疹病毒属成员成熟F蛋白的F2亚基上都包含一个保守的NXS／T（X代表任何氨基酸）糖基化位点[24]。PPRV中有3个糖基化位点NLS、NIT和NCT，氨基酸位点分别为25～27、57～59、63～65，它们的功能有待进一步研究。

2.3.5 血凝素蛋白(HN) HN蛋白或者H蛋白是麻疹病毒中保守性最差的蛋白质之一。RPV和PPRV的氨基酸一致性仅为50%。这些差异可能反映了宿主体液免疫反应主要针对HN蛋白以及细胞嗜性的特异性。PPRV Nigeria 75/1 H蛋白的ORF为7326～9152 nt，编码大小为67kDa的HN蛋白。在麻疹病毒中，H蛋白介导病毒结合到宿主细胞受体是病毒感染增殖的第一步。H蛋白是麻疹病毒中细胞嗜性的决定因素，也是兔化牛瘟病毒跨种致病的主要原因[27]，表明H蛋白是麻疹病毒属中重要的抗原决定簇。

麻疹病毒野生毒株和疫苗株都利用SLAM（信号转导淋巴细胞激活分子，也称CD150）作为细胞表面受体[28]，而适应组织培养的疫苗株可利用CD46作为细胞表面受体。尽管鼠源SLAM与人源SLAM有较高的结构和功能相似性（氨基酸相似性为60%），但却不能作为麻疹病毒受体。普遍认为58～67氨基酸位点的保守性基序是导致人源与鼠源SLAM受体差异的关键[29]。有研究表明7个残基对人源SLAM和麻疹病毒之间的相互作用至关重要，其中6个（Y529、D530、R533、F552、Y553和P554）在PPRV中是保守的[30]。Pawar等[31]研究结果与上述结果一致，他们通过siRNA技术证实SLAM可以作为PPRV的共受体。

在某些副粘病毒中，糖蛋白不仅发挥血球凝集的作用，还发挥神经氨酸酶功能。然而麻疹病毒属中只有 MV和PPRV具有血球凝集功能[32]。目前普遍认为麻疹病毒属中（特别是PPRV）HN蛋白不仅负责病毒吸附在细胞表面及红细胞凝集，还具有神经氨酸酶功能。

2.3.6 大蛋白（L） PPRV L蛋白长度为2183个氨基酸，预测分子量为247.3 kDa。L蛋白质和P蛋白共同发挥RNA依赖的RNA聚合酶活性，负责基因组RNA的转录和复制，包括起始、延伸和终止。L蛋白还有对病毒mRNA进行加帽、甲基化和多聚腺苷酸化的作用。研究表明，L蛋白质由3个保守结构域组成，每个区域具有不同的功能[33-34]。这3个区域中，前2个带正电，第3个带负电。N端域（氨基酸1～606）携带1个RNA结合基序KEXXRLXXKMXXKM（X代表任何一个氨基酸），该基序高度疏水，被赖氨酸有节奏的隔开。第二个结构域（氨基酸650～1694）含有两个基序，分别位于771（QGDNQ）和1464（GDDD），这两个区域被认为与RNA聚合酶功能位点有关[35]。第三个区域不仅携带ATP结合位点（氨基酸1788），而且行使激酶活性功能[35]。

2.3.7 C蛋白 PPRV的C蛋白是由117个残基组成的短蛋白，预测分子量为20.11 kDa。最近有研究表明RPV的C蛋白可以抑制干扰素β的产生[36]，但其分子机制有待探索，很可能是由于C蛋白抑制了干扰素β增强子生成所需的转录因子的激活。C蛋白已被证实是MV感染[37]和RPV增长[38]的一个毒力因子，但PPRV中C蛋白的生物学功能了解很少，有待进一步研究。

2.3.8 V蛋白 在麻疹病毒属中V蛋白的长度是不同的。PPRV中含有298个氨基酸，而CDV和RP有299个氨基酸，预测V蛋白分子量为 32.28 kDa。有研究表明V蛋白与N和L蛋白有关，这一发现表明V蛋白参与调控病毒RNA的合成[39]。虽然V蛋白的具体功能还不明确，但是Tober等[40]发现缺乏V蛋白能够增加病毒复制，表明V蛋白在转录过程中发挥作用。V蛋白在天然免疫方面的研究相对透彻。大多数副粘病毒都具有抵抗干扰素的作用，但是不同病毒间的抵抗机制及其涉及的相关蛋白又有所差异。值得注意的是，缺乏V蛋白或共半胱氨酸富含区的重组病毒在体内都会出现体内增长减缓，这可能是由于其对抗干扰素的功能所致[41]。

3 PPRV的复制机理

PPRV首先通过HN蛋白与细胞表面受体（SLAM或其他未明确的受体）结合，引起F蛋白构象发生改变并释放融合肽，导致病毒包膜与细胞膜发生融合，释放螺旋化的核衣壳到胞质中，从而开始病毒的转录，此时L蛋白作为依赖于RNA的RNA聚合酶启动mRNA的合成。PPRV复制过程也需要其他蛋白参与。简单的说，P蛋白调控N蛋白的转录、复制及组装成核衣壳的过程，M蛋白介导病毒组装过程，HN蛋白发挥神经氨酸酶作用，可促进病毒的出芽过程。病毒基因组拷贝由小基因组通过复制中间体生成。PPRV中C和V蛋白的功能尚不清楚，据说这些蛋白能够消除胞内干扰素（IFN-α/β）反应，因此在PPRV毒力方面有所贡献。

4 PPR疫苗研究进展

由于麻疹病毒间功能和结构上的相似性，已研发出的或正在研发的PPRV的疫苗的策略与其他麻疹病毒相同。PPRV的疫苗已经取得了重大进展，可以简单地分为4类。

4.1 弱毒疫苗

4.1.1 异源PPRV弱毒疫苗 由于PPRV与RPV有较高同源性，因此组织培养的RPV Kabete O株疫苗曾广泛用于PPR的防控[42]。该疫苗具有良好的免疫效果，但随着全球牛瘟根除计划的实施，现已被禁止使用。

4.1.2 同源PPRV弱毒疫苗 目前应用较广的PPRV弱毒疫苗为 Nigeria75/1弱毒疫苗和 Sungri/96 弱毒疫苗。Nigeria 75/1 是通过 Vero 细胞连续传代研制出的弱毒疫苗，该疫苗对免疫接种动物不但具有抗PPRV的保护作用，并且也有抗RPV的保护作用。第二个成功弱化的PPRV病毒是Sungri/96，该病毒从印度Sungri地区病死山羊中分离得到，此分离株在Vero细胞直接传代56代后弱化[43]。

4.2 PPRV重组标记疫苗

4.2.1 异源PPRV标记疫苗 Romero等[44]研究表明包含RPV的H或F基因的重组山羊痘病毒建立了完整的抗PPRV的保护。尽管该疫苗可以保护动物免受PPRV的感染，但它并没有限制PPRV的早期复制。

4.2.2 同源PPRV标记疫苗 由于目前缺乏良好的PPRV感染性克隆体系，于是RPV感染性克隆体系被用于开发PPRV标记疫苗。Das等[45]构建了F和HN基因被PPRV相应基因取代的重组牛瘟病毒，此疫苗可以保护接种动物免受PPRV的感染。

4.3 多价疫苗 由于PPRV可以与其他病毒发生并发感染，所以多价苗的开发迫在眉睫。Chaudhary等[46]已经研制了针对绵羊痘（Romanian Fanar strain）和PPRV（Sungri/96 strain）的二价苗。这个二价苗可以保护动物不受PPRV和绵羊痘的感染。多价苗的使用为疫苗接种带来了便利，并且明显降低了疫苗成本。

4.4 DIVA（区分自然感染与接种疫苗动物）疫苗 传统PPR疫苗具有诸多优势，但也存在一些缺陷：热稳定性较差；存在毒力返强风险；使用弱毒苗不能区分自然感染与人工免疫的动物等。因此急需开发DIVA疫苗。最近，Buczkowski等[47]报道了一种标记麻疹病毒属疫苗的新机制，使用RPV进行验证且讨论了这种方法对于开发PPRV DIVA疫苗的适用性。

图2 PPRV的生命周期[43]Fig.2 Life cycle of PPRV[43]

5 展望

近年来由于PPR疫情时有发生，引起了世界各国的广泛关注，虽然PPR相关研究已取得些许进展，但全球性消灭PPR的目标还任重而道远。目前PPR相关研究急需解决以下问题：第一，高效反向遗传系统有待建立：反向遗传操作技术是指通过构建病毒基因组cDNA克隆，在培养细胞或易感宿主中重新“拯救”病毒。通过基因插入或缺失等，进行病毒基因功能研究和新型疫苗的研制。此外，反向遗传技术也可用于蛋白质与核酸之间的相互作用研究。小反刍兽疫病毒反向遗传研究开展较晚。Bailey等[48]构建了小反刍兽疫病毒Turkey 2000株微型基因组并验证其功能。我国研究者成功拯救了PPRV疫苗株Nigeria 75/1并进行外源蛋白的表达[49]，但其拯救效率不高。第二，PPRV分子致病机制及其免疫调节机制有待研究：PPRV临床评估取得了重大进展，但其分子致病机制研究仍然匮乏。此外，PPRV的嗜神经性也有待研究。目前最为重要的是阐明小反刍动物提前产生针对PPRV N蛋白的机制，这或许是病毒特异性细胞免疫的主要目标。此外，利用IFN-γ等细胞因子模拟类似反应，也将有助于阐明PPRV免疫抑制与免疫调节的相关机制。