晋东南猪源大肠杆菌血清型调查与药敏试验

申子平，孔庆娟，郭丹丹

（长治职业技术学院动物科学系，长治 046000）

大肠杆菌属于猪体内的常驻菌，一旦免疫力下降或环境变化就会引起仔猪发病。随着养殖规模的不断扩大，晋东南养猪场猪大肠杆菌病频繁发生。由于流行的大肠杆菌抗原血清型尚不明确，防治效果较差。本研究对晋东南地区10个县区的养猪场进行取样，进行大肠杆菌的分离、培养和鉴定及药敏试验。以明确晋东南猪大肠杆菌病的抗原血清型，进一步找出治疗该病的高效药物。

1 材料与方法

1.1 病料 在晋东南地区沁县、武乡、襄垣、黎城、平顺、沁源、长子、长治、壶关和陵川等10个县的15个养猪场，采集具有大肠杆菌病典型症状的病猪或病死猪的直肠内粪便，或者截取猪的十二指肠作为病料，共采集51份。

1.2 试剂 营养琼脂和营养肉汤购自上海哈灵生物科技有限公司；麦康凯培养基购自上海博微生物科技有限公司；微量生化鉴定管购自广东环凯有限公司；药敏片购自杭州微生物试剂有限责任公司；伊红美蓝琼脂购自广东环凯有限公司；大肠杆菌O抗原定型血清购自宁波天润生物药业有限公司。

1.3 大肠杆菌的分离、培养 在伊红美蓝琼脂培养基上无菌接种病料，37℃培养24 h，挑取有金属光泽、紫黑色的单菌落，涂片、染色，镜检判断[1]。挑取镜检后的单菌落分别接种到营养琼脂培养基、营养肉汤和麦康凯培养基，37℃培养24 h，镜检。挑取在麦康凯琼脂上生长的砖红色单菌落[2]，接种于营养琼脂培养基，37℃培养24 h后，保存于4℃备用。

1.4 生化试验 挑取纯化后的菌落，按照常规方法进行生化反应试验[3]。生化试验有15项：葡萄糖、赖氨酸、甘露醇、鸟氨酸、麦芽糖、MR、吲哚、果糖、尿素、VP、枸椽酸盐和H2S等。

1.5 分离菌血清型鉴定 用2 mL含有石碳酸（0.5%）的生理盐水洗下纯化扩繁后的培养物，稀释后密封于玻璃管内，121℃灭菌2 h，备用。用微量移液器吸取灭菌后的待测液，加1滴到玻板上。另换枪头吸取单因子定型血清，滴1滴到抗原内，立即混匀，静置5 min后观察结果。如果出现凝集现象明显，则为阳性。灭菌后的待测液和生理盐水混合液作为空白对照[4]。

1.6 分离菌毒力试验 选取体重20 g左右的小白鼠，分为实验组和对照组，每组小白鼠3只。取纯化培养后的细菌接种于营养肉汤，37℃培养24 h，培养后计数并稀释。每只小鼠腹腔接种0.3 mL稀释后的细菌液，而对照组小鼠则腹腔接种0.3 mL灭菌后的生理盐水。接种后仔细观察小鼠存活情况，做好记录。取病死鼠的病料接种于麦康凯琼脂上培养，挑取培养后的菌落染色镜检。使3只小鼠菌死亡的菌株为强毒力菌株；可致2只小鼠死亡的菌株为中等毒力菌株；仅致1只小鼠死亡的菌株为低毒力菌株；无死亡为无毒株的标准[5]。

1.8 药敏试验 测定用K-B纸片法进行[6]。用于测定的药物包括：头孢吡肟、阿莫西林、环丙沙星、头孢唑啉、阿米卡星、链霉素、利福平、呋喃唑酮、头孢曲松、卡那霉素、氟苯尼考和氧氟沙星等[7]。采用药物的抑菌圈直径（d）来判断细菌对该药物的敏感性：d≥16 mm为敏感；d＜10 mm为耐药；10 mm≤d＜15 mm为中介。

2 结果与讨论

2.1 培养与镜检结果 经培养与镜检初步确定，51份病料中47份可分离到大肠杆菌。菌落在麦康凯琼脂上为红色；在伊红美蓝培养基上为带金属光泽的紫黑色单菌落；在营养琼脂上为边缘规则的光滑圆形菌落，且呈灰白色的半透明状；在营养肉汤中呈浑浊样，管底有白色沉淀，管上有菌环，闻管口有臭味。用分离菌涂片，染色后镜检，可见分离菌为无芽孢的革兰氏阴性菌，两端钝圆且染色略深，分布分散，偶有几个连于一起。

2.2 分离菌生化试验 对47株分离菌进行15项生化试验，结果见表1。在生化试验中葡萄糖、赖氨酸、甘露醇、鸟氨酸、麦芽糖、MR、吲哚、果糖几个项目的试验阳性率为100%[8]，而在尿素、VP、枸椽酸盐和H2S项目的阳性率为0%（表1）。分离细菌符合大肠杆菌的特性。

2.3 分离菌血清型鉴定 47株分离细菌确定O抗原的有42株，没有确定类型的有5株。42株分离菌共有12个血清型，主要有O138、O2、O107和O152，分别占已定型菌的19.05%、14.29%、11.90%和11.90%，合计占已定型菌株数的57.14%（表2）。由此可见，O138、O2、O107和O152是晋东南地区猪大肠杆菌主要血清型。因此，在预防该菌引起的仔猪疾病时应以O138、O2、O107和O152血清型为主要对象。

2.4 毒力测定 实验组小鼠出现了呼吸急促、拉稀等症状，并有大量小鼠相继死亡。47株分离菌中具有强致死力的菌株数为25株，占53.19%；有38株引起小鼠死亡，占到总数的80.85%。小鼠的死亡时间主要集中在接种后24 h。典型的病变为肝出血、肿大，心包淤血，脾肿大等。47株分离大肠杆菌中有9株大肠杆菌没有引起小鼠死亡。另外，对照组的小鼠没有出现死亡情况，剖检也无病理变化[9]。说明，在晋东南存在的猪源大肠杆菌致病力很强。养猪时应该对仔猪黄、白痢和水肿病重视[10]。

表1 分离菌生化试验结果Table 1 Biochemical test result of E.coli isolates

表2 分离菌血清型鉴定Table 2 Identifi cation serotyping of E. coli isolates

表3 分离菌毒力强弱测定结果Table 3 Virulence measurement result of E. coli isolates

表4 38株大肠杆菌对15种药物的敏感情况Table 4 Sensitivity of 38 E. coli isolates to 15 kinds of drugs

2.5 药敏试验 采用15种药物对致小鼠死亡的38株细菌进行了敏感性测定，结果见表4。分离的大肠杆菌菌株对头孢吡肟敏感性最强（敏感率89.47%），其次是阿米卡星（敏感率81.58%）、呋喃唑酮（敏感率73.68%）和氧氟沙星；中介毒株对氟苯尼考最为敏感（敏感率68.42%）；而对利福平敏感性最低，耐药性最强，其次是阿莫西林和大观霉素。所以在该区治疗仔猪黄、白痢和水肿病时应首选头孢吡肟，其次是阿米卡星、呋喃唑酮和氧氟沙星；少用庆大霉素和氟苯尼考；禁用利福平、阿莫西林和大观霉素等作用效果差的药物。

经过近几年的调查，发现晋东南地区的养猪场兽医人员短缺，许多养殖人员不具备科学用药知识，由于引起猪大肠杆菌病的血清型种类过多，随意用药造成了细菌的抗药性增加[11]。

大肠杆菌引起的仔猪疾病较多，在晋东南广泛流行，有的猪场大肠杆菌对仔猪致死率达到了50%，甚至更高。本调查为晋东南猪大肠杆菌病的有效预防和治疗提供了理论基础。