一株鸡大肠杆菌的分离鉴定与耐药性研究

江林宜

（江苏省连云港市灌南县百禄动物防疫检疫所，灌南 223500）

鸡大肠杆菌病在临床上可单独发生或与其他疾病混合感染，引起胚胎死亡、脐炎、败血症、输卵管炎、滑膜炎、肉芽肿、卵黄性腹膜炎和眼炎等一系列病症。病原体E.coli抗原性复杂，血清型多样，鸡感染后的临床症状和病理变化多变[1]。

1894年Ligniers首次报道E.coli可引起禽类大批死亡。近年来，随着养鸡业的发展，集约化程度的不断提高和鸡新品种的增加，鸡大肠杆菌病的发生日趋严重，流行范围逐渐扩大，给养鸡业带来了严重的危害，已成为鸡群重要的细菌性疾病之一[2]。在临床治疗中使用的大量抗菌药物，导致大肠杆菌耐药菌株不断出现，耐药谱不断扩大，形成恶性循环[3]。同时，抗菌药物在畜禽体内的残留还给养禽业的持续发展和人类的身体健康带来潜在危害[4]。调查鸡大肠杆菌耐药性现状，对指导兽医临床用药是十分必要的[5]。

本研究对送检的疑似大肠杆菌病例进行了病原的分离鉴定，并对分离菌的培养特性、生化特性等进行分析，为鸡大肠杆菌病的诊断和防治提供依据[6]。

1 材料与方法

1.1 病料来源 样品来自江苏省灌南县百禄镇动物防疫站收集的1只发病鸡。发病鸡缩头、垂翅，大便拉稀，病程5～6 d。

1.2 材料与试剂 生化管购自杭州微生物试剂有限公司；16s rDNA Bacterial Identification PCR Kit购自宝生物工程（大连）有限公司； LB琼脂平板、麦康凯培养基均按通用的配制比例及使用说明自行配制，其中琼脂粉和麦康凯购自上海中科昆虫生物技术开发有限公司；药敏试验纸片为杭州微生物试剂有限公司产品。

1.3 细菌分离 采集发病鸡的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等器官组织，无菌条件下在麦康凯琼脂平板上划线培养，37℃温箱培养24～48 h后，观察结果。挑取典型菌株再接种于LB琼脂平板和麦康凯培养基上继续培养，观察细菌的生长情况。

1.4 革兰氏染色 用接种环挑取生理盐水蘸于洁净玻片上，再挑取适量的分离细菌纯培养物与玻片上的生理盐水混合，均匀涂布；自然干燥后用火焰固定，在玻片上滴加结晶紫染色液，1～3 min后水洗；加碘液媒染，1 min后水洗；加95%酒精脱色，15～30 s后水洗；最后加沙黄复染1 min后水洗，自然干燥后镜检，观察细菌染色与形态。

1.5 生化试验 将分离菌株分别接种到含有下列培养基的生化管中：葡萄糖、棉子糖、乳糖、果糖、甘露糖、木糖、卫茅醇、赖氨酸、鸟氨酸、阿拉伯糖、苯丙氨酸、H2S。接种后置于37℃恒温箱中培养24 h，然后观察生化管中培养基的变化情况。通过细菌微量生化管对所分离的菌株进行生化指标测定，初步判定细菌菌属。生化试验判定标准参考杭州微生物试剂有限公司生化管使用说明。

1.6 16S rDNA基因序列分析 根据GenBank中公布的大肠杆菌16S rDNA通用引物，选用 16S rDNA引物。27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。预期扩增出的目的片段大小为593 bp，引物均由上海杰李生物公司合成[7]。PCR反应体系（25 μL）：10×Buffer（含Mg2+20 mmol/L）2.5 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）0.5 μL，上下游引物（20μmol/L）各0.5 μL，TaqDNA 聚合酶（1 U/μL）2.5 μL，大肠杆菌DNA 1.5 μL，补ddH2O至25 μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性30 s，50℃退火1 min，72 ℃延伸1min30 s，共30个循环；最后72 ℃延伸10 min，4℃保存[8-9]。

1.7 药敏试验 采用世界卫生组织（world health organization，WHO）推荐的Kirby-Bauer法进行药敏试验。药敏纸片：氧氟沙星5 μg/片，氯霉素30 μg/片，青霉素10 μg/片，复方新诺明25 μg/片，恩诺沙星5 μg/片，卡那霉素30 μg/片，庆大霉素10 μg/片，诺氟沙星10μg/片，头孢曲松钠（菌必治）30 μg/片，萘啶酸30 μg/片，氟苯尼考30 μg/片，美洛西林75 μg/片，四环素30 μg/片，链霉素10 μg/片。挑取分离菌株，涂布到琼脂平板，用无菌镊子将药敏纸片平贴于培养基表面，于37℃温箱中培养24 h后测量抑菌圈直径。药敏试纸判定标准参照世界卫生组织（WHO）公布的标准。

2 结果与讨论

2.1 病鸡的大体病理变化 解剖发病鸡发现，该病鸡患有严重的肝周炎，肝脏肿大变硬，表面有纤维蛋白附着（图1），同时患有心包炎、气囊炎、腹膜炎。

2.2 细菌分离结果 发病鸡器官组织在营养琼脂平板上37℃培养24 h后，形成中等大小，圆形微凸起，表面光滑湿润，浅灰色半透明的菌落。在麦康凯琼脂平板上，形成中等大小，表面光滑湿润的粉红色菌落（图2）。革兰氏染色为阴性杆菌，符合大肠杆菌的培养特性[10]。

图1 病鸡肝脏病变（A）及心脏病变（B）Fig.1 Pathological changes of liver(A) and heart(B) of the sick chicken

图2 分离菌株在麦康凯琼脂平板上的菌落形态Fig.2 Red colony on the Mac Conkey agar

2.3 生化试验结果 结果显示分离菌能够发酵葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、棉子糖等大多数糖类，并产酸产气，鸟氨酸和赖氨酸试验阳性，苯丙氨酸和硫化氢阴性。生化试验结果符合大肠杆菌特性（表1）。

表1 分离菌株的生化试验结果Table 1 Biochemical test results of isolated strains

2.4 16S rDNA 基因序列分析 PCR产物经1%琼脂糖凝胶，得到目的片段（图4），然后将目的片段送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序，最后将测定的序列在NCBI网站进行BLAST搜索比对，16S rDNA 基因序列分析结果显示分离菌为大肠杆菌[11-12]。

图3 分离菌的PCR检测结果Fig.3 PCR detection of isolated strain

2.5 药敏试验结果 本研究选择了14种常用抗菌药物对分离菌株进行药敏试验[13]，药敏试验结果表明，分离菌株对菌必治、美洛西林、恩诺沙星、诺氟沙星的敏感性较高，而对萘啶酸、青霉素等耐药（表2）。

表2 分离菌株的药敏试验结果Table 2 Drug susceptibility test results of isolated strain

临床治疗应避免盲目用药，需在药敏试验的指导下，选择大肠杆菌高度敏感的药物进行有效治疗[14]。治疗鸡大肠杆菌病应找专业兽医人员进行诊治，避免随意乱用药。根据日龄、病情轻重、采食状况、用药史等情况进行综合考虑，合理使用药物，制定出最佳的治疗方案，最好实行交替用药和配合用药[15]。