2013-2016 年江西省麻疹病毒分离株H基因特征分析

张艳妮，龚甜，李健雄，施勇，徐刚

（江西省疾病预防控制中心，江西 南昌 330029）

麻疹是一种由麻疹病毒引起,主要经呼吸道传播的儿童常见传染病。麻疹病毒属于副粘病毒科，麻疹病毒属。WHO 根据麻疹病毒基因信息，将麻疹病毒分为8 个组23 个基因型别[1,2]，但是目前在全世界范围内流行的只有18 个基因型别[3,4]，麻疹病毒虽然基因型别众多，但却只有一个血清型。麻疹病毒基因组有6 个结构基因和2 个非结构基因,而6 个结构基因编码6 个结构蛋白,其中编码核蛋白（nucleoprotein,N）基因和血凝素蛋白（hemagglutinin,H）基因是麻疹病毒核苷酸发生变异的主要区域[5]。血凝素蛋白由1854 个核苷酸组成，编码617个氨基酸。麻疹病毒N 基因C 末端的450 个碱基就可以对麻疹病毒的基因型别做出判定,但是麻疹病毒的中和抗原主要集中在H 基因上,为了更好的掌握江西省麻疹病毒的流行基因型及流行基因型的变异情况，有效防控麻疹的流行，本文对2013-2016 年在麻疹监测中挑选75 株麻疹毒株进行了血凝素（H）基因的序列测定，并与GenBank 中中国麻疹疫苗株和各基因型别的代表株进行序列比对，分析其亲缘关系、同源性等变异情况，以期可以为江西省麻疹防控策略的制定和实施提供科学有效的依据[6]。

1 材料与方法

1.1 标本的采集 根据《全国麻疹监测方案》的要求，对报告的疑似麻疹病例，采集出疹3d 内的咽拭子标本,标本采集后保存在3ml 病毒保存运输液中（含5%牛血清、终浓度2000U/ml 青霉素、200μ/ml 链霉素和25μ/m 制霉菌素）。实验室在收到病原学标本后7d 内完成核酸检测, 对核酸检测结果阳性的标本进行麻疹病毒的分离培养。

1.2 麻疹病毒的分离培养 将咽拭子标本接种于生长状态良好且覆盖率达到80%~90%的单层Vero-Slam 细胞，吸附1.5h 后弃去上清，斜面管中加入2ml 含2%牛血清的细胞维持液，放37℃培养箱中培养7d，每日观察细胞生长情况。麻疹病毒可以在Vero-Slam 细胞上可以出现特异性的细胞融合病变,当观察到CPE 时,可收获细胞培养液；对未观察到细胞病变的样本，连续盲传3 代，若至第三代结束仍未观察到CPE,则此标本判断为阴性。

2 病毒核酸提取、扩增、测序

2.1 核酸提取 取病毒培养物200μl，使用Qiagen公司的Rneasy Mini kit 提取试剂盒提取病毒的总RNA，具体操作步骤见试剂盒使用说明书。

2.2 麻疹病毒的鉴定 麻疹病毒的鉴定使用硕世生物的麻疹风疹双通道荧光定量RT-PCR 试剂盒进行鉴定，荧光PCR 仪为ABI7300。反应体系及检测程序均参考试剂盒使用说明书。

2.3 扩增麻疹病毒H 基因全长及序列测定 扩增H 基因的引物参考文献[8]，扩增体系使用QIAGEN One Step RT-PCR Kit 试剂盒进行RT-PCR 反应，体系配制参考试剂盒使用说明书。反应条件参考文献[9]。扩增产物送上海生工进行序列测定。

2.4 序列比对分析 使用DNAStar 和MEGA5.0 软件对获得的核苷酸序列进行比对分析，并构建进化树。构建进化树的麻疹病毒各基因型的参考株和标准株基因序列均从GenBank 下载。各基因型参考株序列登录号为：AF045201(CHN/93/7)、AF04 5203 (CHN/94/1)、AF045202(CHN/94/7)、AF045196(CHN/93/2)、U03663（Shanghai-191）。

3 结果

3.1 麻疹病毒分离 2013 年-2016 年江西省麻疹风网络疹实验室共收到麻疹病毒核酸检测阳性的咽拭子标本260 例,对260 例标本都进行病毒分离培养，共分离到麻疹病毒株80 株，病毒分离率为30.77%。见表1。

表1 2013 年-2017 年江西省麻疹病毒分离情况

由表1 可以看出，2013 年-2016 年的病毒分离率多在30%左右，只有2014 年的病毒分离率为41.46%，略高与其他3 年。

3.2 荧光-PCR 鉴定结果 经病毒分离培养共获得80 株病毒分离株，使用硕世生物的麻疹风疹双通道荧光定量RT-PCR 试剂盒对其进行鉴定，经鉴定，所得到的80 株病毒分离株均为麻疹病毒株。

3.3 H 基因序列结果分析 挑选75 株麻疹病毒株进行H 基因的扩增，扩增的产物直接送上海生工进行序列测定，对测得的序列进行分析拼接，75 株毒株均 H 基因序列的长度均为 1854bp；用MAGE5.0、DNAStar5.0 软件对得 H 基因序列进行分析比对,各分离株H 基因之间的核苷酸同源性为97.86%~100%,与疫苗株Shanghai-191 H 基因的核苷酸同源94.23%~94.71%, 与H1 基因型代表株CHN/93/7 （AF045201）H 基因的核苷酸同源性为97.69%~98.36%, 与H1a 基因型代表株CHN/93/2（AF045196）H 基因的核苷酸同源性为 98.41%-99.02%, 与 H1c 基因型代表株 CHN/94/7（AF0452 02）H 基因的核苷酸同源性为96.90%~97.58%，与H2 基因型代表株 CHN/94/1 （AF045203）H 基因的核苷酸同源性为96.44%~97.13%。

3.4 H 基因进化树分析 对75 株麻疹病毒分离株进行核酸提取并扩增H 基因，扩增产物送上海生工进行双向序列测定，测序结果进行拼接后，获得75 株麻疹病毒H 基因的序列长度均为1854bp。使用DNASTAR、MAGE5.0 软件对各个序列之间的同源性进行序列比对分析，并做进化树，见图1。

由图1 可以看出，75 株分离株的 H 基因与H1a 基因型分属于同一个分支，属H1a 基因型。但是75 株毒株，又形成了两个独立的小分支，其中2013 年和2014 年的11 株毒株位于一个分支上，剩余64 株毒株则集中在另外一个分支上。由64株病毒构成的大分支又可以分为两个部分,分支一由 40 株毒株（2015 年和 2016 年的毒株）构成，分支二由 24 株毒株（2013 年、2014 年和 2015 年）构成。由此推断，在 2013 年-2014 年，江西省可能存在两个病毒传播连，其中一个 （11 株） 传播链在2014 年以后，消失了；而另一个传播链则继续在流行传播，这一传播链中的某一优势毒株，渐渐取代了其他的毒株，在2015 年和2016 年成为流行株，广泛传播。

3.5 氨基酸同源性分析 H 基因共有1854bp,由此可以推断氨基酸数为617，各分离株之间H 基因氨基酸的同源性为97.7%~100%，与疫苗株Shanghai-191 H 基因氨基酸同源94.50%~95.69%，与H1 基因型代表株 CHN/93/7（AF045201）H 基因的氨基酸同源性为97.04%~98.20%, 与H1a 基因型代表株CHN/93/2 （AF045196）H 基因的氨基酸同源性为98.2%~99.02%，与 H1c 基因型代表株 CHN/94/7（AF045202）H 基 因 氨基 酸 同 源 性 为 96.54%~97.7%，与 H2 基因型代表株 CHN/94/1（AF045203）H 基因氨基酸同源性为96.7%~97.87%。以shanghai-191 的H 基因氨基酸为标准，分析75 株分离毒株的H 基因的氨基酸构成存在的变异。经分析得知，有22 个氨基酸发生了完全置换，完全置换的位点 18 P-S，133 L-F，149 D-N，211 G-S,240 S-N,243 R-G,279 L-F,280 V-I,303 E-G,359 A-F,364 K-N,405 N-S,420 T-A,421 V-A,423 L-P,476 F-L,481 Y-N,484 N-T,506 D-G,562 V-T,576 K-R,609 T-N； 另有19 个位点发生了部分氨基酸的置换。

图1

4 讨论

本研究分析了2013 年-2016 年江西省75 株麻疹毒株进行的H 基因的全序列的测定，测序结果显示，所有毒株的基因型别均为H1a 基因型，与此前施勇[6]、张艳妮[7]等人监测的 2008-2013 年江西省麻疹毒株基因型别相同,说明从2007 年-2016年, 麻疹病毒H1a 基因型一直是江西省优势基因型，这与全国的麻疹病毒监测结果是一致的。进化树结果显示，H1a 基因型2013 年-2016 年麻疹病毒优势基因型，但是在传播过程中，又存在不同的传播链。进化树显示，2013 和2014 年的毒株分部于两个分支中, 说明在2013 年、2014 年有两个传播链在共同传播，一个传播链在2014 年以后消失了，这可能与麻疹免疫接种策略有关，适龄儿童及时进行麻疹疫苗的接种，阻断了病毒的传播途径；另一分支中的某一毒株在流行传播过程中,渐渐成为优势株，在2015 年、2016 年广泛流行。各分离株H 基因在氨基酸和核苷酸上的变异性不大，分别为97.7%~100%和 97.86%~100%。但是与疫苗株Shanghai-191 的同源性存在一定差异,有可能是出现抗原漂移。75 株麻疹毒株均保留了5 个糖基化位点中的4 个位点, 只是第5 个位点的氨基酸在240 位由S 变为N，导致了麻疹病毒的一个潜在的糖基化位点的缺失，与文献报道[10]的中国流行的麻疹病毒的基因特点相一致；单元春[12]、陈国清[13]等人发表的关于麻疹病毒血凝素蛋白变异情况的研究结果与本文相同，即第五个糖基化位点缺失，可能导致麻疹病毒发生抗原漂移。H 基因上的多个氨基酸发生了置换,可能会导致H 蛋白的表面位点发生改变，使中和抗体水平下降，影响疫苗的免疫效果。

我省自2007 年至今流行的优势株一直是H1基因型[11,6]，但是随着经济发展，人员流动速度和规模越来越大,麻疹病毒地域性的流行特点有可能会被打破。近年来，全国多省份相继发现并报道了麻疹病毒其他基因型，如2012 年上海发现并报道了中国首例输入性 D8 基因型[5]； 2017 年-2019 年江苏省发现并报道了输入性D8 和B3 基因型[14]；福建[15]、辽宁[16]、四川[17]等地也发现并报道了其他的基因型。H 基因决定的H 蛋白，是麻疹病毒重要的中和抗原，更加深入的研究H 基因，进而了解麻疹病毒的抗原是否发生改变。加强麻疹病毒的监测，才有可能及时的发现是否有基因型别其他麻疹病毒在流行，从而为江西省的麻疹免疫策略的制定，提供有效的理论支撑。