不同检验方案对碳青霉烯类非敏感类肠杆菌科细菌检测的临床应用

凌敏

（周口市中心医院检验科，河南 周口 466000）

碳青霉烯类抗生素是治疗肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia，KP)的最重要手段之一[1]，随着碳青霉烯类抗生素大规模生产及不规范应用，临床出现了以肠杆菌科细菌为主要代表的对碳青霉烯类不敏感的细菌菌株，包含沙雷菌属、埃希菌属、克雷伯菌属、沙门菌属等[2]，多重耐药细菌的出现给临床治疗带来了极大挑战。因此尽早准确检测出碳青霉烯类非敏感类肠杆菌科细菌（carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE） 对临床阻断或减缓耐药菌传播有重要意义。目前检测碳青霉烯类非敏感类肠杆菌科细菌的主要方法有改良Hodge 试验 (Modified Hodge Test，MHT)、Carba NP direct 试验(CNPt-d)、Carba?NP 试验(CNPt)等[3]，但MHT、CNPt-d、CNPt 三种检测方法的比较国内还鲜有报道。本研究收集我院2018 年5 月-2019 年5 月临床分离的碳青霉烯类非敏感类肠杆菌科细菌138 株，以PCR 检测为金标准，对比研究MHT、CNPt-d、CNPt 在碳青霉烯类非敏感类肠杆菌科细菌检测中的应用价值，以期指导临床合理用药，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 收集我院 2018 年5 月-2019 年5月临床分离的碳青霉烯类非敏感类肠杆菌科细菌138 株用于本研究。入选标准：⑴采用珠海迪尔生物工程有限公司的DL-96 细菌鉴定仪进行细菌鉴定及药敏试验，药敏结果解释参照美国临床和实验室标准研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推荐的 M100-S25 标准，质控菌株为ATCC 700603 及ATCC 25922；⑵碳青霉烯类不敏感表现为对第三代头孢噻肟、亚胺培南、多利培南、头孢曲松、美罗培南具有耐药性；⑶标本来源于引流液、血液、胸腹水、尿液、痰液等。排除标准：⑴重复菌株；⑵药敏结果解释未参照美国CLSI 推荐的M100-S25 标准。

1.2 检测方法 ⑴PCR：采用DNA 提取试剂盒（美国Mpbio 公司）提取细菌 DNA，使用PCR 仪（美国Bio-Rad 公司） 扩增碳青霉烯酶基因 blaKPC、blaNDM、blaVIM。PCR 反应体系为：模板 2μl、200 μmol/L dNTPs 4μl、10×buffer 5μl、Taq 聚合酶 1.5 U、5μmol/L 上下游引物各 2μl, 用 ddH2O 补足至50μl。PCR 反应条件为：94℃预变性 30s，94℃变性5s，58℃退火 34s，72℃延伸 30s，40 次循环。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，PCR 阳性产物上Miseq 测序仪（美国Illumina 公司）测序，测序结果用Chromas 直接作 BLAST Search 比对。

⑵MHT： 参照 CLSI 推荐的 M100-S24 进行试验。将0.5 麦氏单位的大肠埃希菌ATCC25922 稀释10 倍后按常规纸片法药敏试验涂抹于MHA 平板 （青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）上，待平板干燥5min，平板中间贴10 μg 厄他培南纸片（法国生物梅里埃公司），接种待检菌株，以肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706 为阴性对照，肺炎克雷伯菌ATCCBAA-1705 为阳性对照，37 ℃条件下孵育16~20h 观察结果，若待检菌株与大肠埃希菌抑菌环交汇处呈矢状生长则提示该菌株产碳青霉烯酶。

⑶CNPt： 用 10μl 接种环从 37 ℃培养 18~22h的血平板培养基上直接刮取约1 个接种环细菌的量, 分别混悬于两个加入100μl 细菌蛋白抽提液（北京中科瑞泰生物科技有限公司）的EP 管中，振荡5s，两个EP 管分别加入检测液A（0.05%酚红溶液）和检测液 a（含 0.1mmol/L ZnSO4 溶液、6mg/ml亚胺培南的0.05%酚红溶液），置于37℃孵箱，每0.5h 观察记录颜色变化(2h 内观察为宜)，若颜色由红色变成黄色为阳性则提示待测菌产碳青霉烯酶。

⑷CNPt-d： 用 10μl 接种环从 37 ℃培养 24h的血平板培养基上直接刮取约1 个接种环细菌的量，分别混悬于加入检测液B（含0.1 mmol/L Zn-SO4 溶液、12mg/ml 亚胺培南、0.1%Triton X-100 溶液的0.05%酚红溶液） 的EP 管中和加入检测液b（含0.1%Triton X-100 溶液的 0.05%酚红溶液）的EP 管中,涡旋震荡器(上海基屹生物科技有限公司)上剧烈振荡 1min，静置20~30min，置于 37℃孵箱（温州利邦生物技术有限公司）待用，每0.5h 观察记录颜色变化(2h 内观察为宜)，若颜色由红色变成黄色为阳性则提示待测菌产碳青霉烯酶。

1.3 统计学处理 本研究在spss23.0 软件上采用受试者工作特征曲线分析对碳青霉烯类非敏感类肠杆菌科细菌的筛查价值进行分析。

2 结果

2.1 PCR 检测结果 138 株碳青霉烯类非敏感类肠杆菌科细菌共检测出碳青霉烯酶基因120 株，其中NDM-1 型大肠埃希菌10 株，KPC-2 型肠科杆菌 106 株，VIM-2 型肺炎克雷伯菌 4 株，见图1。

图1 PCR检测结果

2.2 MHT 检测结果 120 株碳青霉烯酶基因阳性的CRE 中，有110 株MHT 检测结果为阳性，阳性率为91.67%。其中KPC-2 型肺炎克雷伯菌MHT阳性率为100%，KPC-2 型大肠埃希菌MHT 阳性率为100%，KPC-2 型黏质沙雷菌MHT 阳性率为60.00%，KPC-2 型产气肠杆菌 MHT 阳性率为66.67%，KPC-2 型弗氏柠檬酸杆菌MHT 阳性率为50.00%，NDM-1 型大肠埃希菌 MHT 阳性率为50.00%，VIM-2 型肺炎克雷伯菌MHT 阳性率为75.00%。MHT 出现阳性结果的反应时间在9~20 min，见表1。

表1 MHT检测结果（n，±s）

表1 MHT检测结果（n，±s）

基因型 菌株KPC-2株数 MHT 阳性（株）85 11 85 11 NDM-1 VIM-2肺炎克雷伯菌大肠埃希菌黏质沙雷菌产气肠杆菌弗氏柠檬酸杆菌大肠埃希菌肺炎克雷伯菌5 3 2 1 0 4 3 2 1 5 3阳性反应时间（min）16.77±3.22 16.11±3.38 16.29±3.37 15.59±3.58 15.47±3.17 11.26±2.25 16.14±3.12

2.3 CNPt 检测结果 120 株碳青霉烯酶基因阳性的CRE 中，有115 株CNPt 检测结果为阳性，阳性率为95.83%。其中KPC-2 型肺炎克雷伯菌、KPC-2 型产气肠杆菌、KPC-2 型弗氏柠檬酸杆菌CNPt阳性率为100%，KPC-2 型大肠埃希菌CNPt 阳性率为95.91%，KPC-2 型黏质沙雷菌CNPt 阳性率为80.00%，NDM-1 型大肠埃希菌CNPt 阳性率为80.00%，VIM-2 型肺炎克雷伯菌CNPt 阳性率为75.00%。CNPt 出现阳性结果的反应时间在5~20 min，见表2。

表2 CNPt检测结果（n，±s）

表2 CNPt检测结果（n，±s）

基因型 菌株KPC-2株数 CNPt 阳性（株）85 11 85 10 NDM-1 VIM-2肺炎克雷伯菌大肠埃希菌黏质沙雷菌产气肠杆菌弗氏柠檬酸杆菌大肠埃希菌肺炎克雷伯菌5 3 2 1 0 4 4 3 2 8 3阳性反应时间（min）16.35±3.50 15.66±3.58 15.87±3.76 15.62±3.98 15.23±3.36 6.38±1.19 15.27±3.38

2.4 CNPt-d 检测结果 120 株碳青霉烯酶基因阳性的CRE 中，有120 株CNPt-d 检测结果为阳性，阳性率为100.00%。CNPt-d 出现阳性结果的反应时间在4~20 min，见表3。

2.5 MHT、CNPt-d、CNPt 对碳青霉烯类非敏感类肠杆菌科细菌的筛查价值 MHT、CNPt-d、CNPt 中，CNPt-d 对碳青霉烯类非敏感类肠杆菌科细菌的检测价值最高，见表4~5、图2。

表3 CNPt-d检测结果（n，±s）

表3 CNPt-d检测结果（n，±s）

基因型 菌株KPC-2株数 CNPt-d 阳性(株)85 11 85 11 NDM-1 VIM-2肺炎克雷伯菌大肠埃希菌黏质沙雷菌产气肠杆菌弗氏柠檬酸杆菌大肠埃希菌肺炎克雷伯菌5 3 2 1 0 4 5 3 2 1 0 4阳性反应时间(min)16.33±3.47 15.57±3.13 15.62±4.05 15.65±3.95 14.76±3.96 5.11±1.02 15.15±3.16

表4 MHT、CNPt-d、CNPt与PCR检测结果比较

表5 MHT、CNPt-d、CNPt对碳青霉烯类非敏感类肠杆菌科细菌的筛查价值（%）

图2 MHT、CNPt-d、CNPt筛查碳青霉烯类非敏感类肠杆菌科细菌的ROC曲线

3 讨论

自19 世纪末20 世纪初青霉素被发现以来，抗生素逐渐成为人类对抗诸多疾病的 “秘密武器”，全球范围内被广泛应用于临床，人类寿命得以大大提高。但随着抗生素的不合理使用，细菌对抗生素耐药性不断增强，抗生素效力普遍下降，世界卫生组织 （World Health Organization，WHO）发布全球范围内每年有约70 万人死于各种耐药菌感染[4]，23 万新生儿因耐药菌感染而夭折[5]，抗生素的耐药性问题已越来越成为医疗卫生领域的重大挑战和难题。碳青霉烯类抗生素是抗菌活性最强及抗菌谱最广的非典型β-内酰胺 （β-lactam，β-LAC）抗生素，已成为治疗严重细菌感染最主要的抗菌药物之一[6]。碳青霉烯顺式构象与青霉烯显著不同，噻唑环上的硫原子为碳所替代，C2、C3之间存在不饱和双键，6 位羟乙基侧链为反式构象，故表现出对β-内酰胺酶的高度稳定性[7,8]。临床近年来出现了较多对碳青霉烯类不敏感的细菌菌株，以肠杆菌科细菌为主要代表。CRE 耐药机制主要为产碳青霉烯酶，碳青霉烯酶的产生常造成碳青霉烯类细菌与青霉素结合蛋白 (Penicillin binding protein，PBP)的亲和力改变，导致主动外排系统高表达，最终使细菌产生耐药性[9,10]。碳青霉烯酶依据Ambler 分子分类系统，可分为包括 IMP、VIM、NDM-1 等基因型的金属酶、包括 KPC、GES、SME、PER 基因型的丝氨酸蛋白酶、由blaOXA 等位基因编码合成的OXA 酶，三类酶在质粒介导下可引起不同水平的耐药性，造成疾病流行，严重危害现代医学进展[11]。本研究采用PCR 检测，结果显示138株碳青霉烯类非敏感类肠杆菌科细菌共检测出碳青霉烯酶基因120 株，其中NDM-1 型大肠埃希菌10 株，KPC-2 型肠科杆菌 106 株，VIM-2 型肺炎克雷伯菌4 株。

MHT 是由CLSI 推荐的临床检测肠杆菌科细菌碳青霉烯酶表型的常规方法，操作简便，不需要大型仪器，适宜大量筛选产碳青霉烯酶菌株，在一般检验科临床微生物室都可开展[12]。然而MHT 只限于肠杆菌科细菌检测,对于检测非发酵菌灵敏度与特异度不高[13]，而CNPt 除运用于CRE 检测外还可运用于不动菌属与铜绿假单胞菌的检测，CNPt具有高效、快速、准确的优点，由Nordmann 教授团队于2012 年首次提出并投入临床使用，逐渐成为检测碳青霉烯类非敏感类肠杆菌科细菌的主流方法[14]，2015 年 Pasteran 等[15]在 CNPt 基础上简化流程得出 CNPt-d，CNPt-d 较 CNPt 操作更加简便，阳性反应更快。据报道[3]MHT、CNPt-d、CNPt 检测碳青霉烯类非敏感类肠杆菌科细菌灵敏度与特异度均超过90%，这与本研究结果相符，本研究结果显示120 株碳青霉烯酶基因阳性的CRE 中MHT 检测阳性率为91.67%，CNPt 检测阳性率为95.83%，CNPt-d 检测阳性率为100.00%，MHT 出现阳性结果的反应时间在9~20min，CNPt 出现阳性结果的反应时间在5~20min，CNPt-d 出现阳性结果的反应时间在4~20min,说明CNPt-d 缩短了操作时间，阳性结果出现时间较短，灵敏度较高。ROC 曲线显示 MHT、CNPt-d、CNPt 中，CNPt-d 检测碳青霉烯类非敏感类肠杆菌科细菌的准确性最高，提示CNPt-d 可作为碳青霉烯类非敏感类肠杆菌科细菌的有效筛查方法应用于临床,指导临床科学谨慎地使用抗生素药物,以缓解抗生素耐药性现状。

综上所述，MHT、CNPt-d、CNPt 均能迅速检测出碳青霉烯类非敏感类肠杆菌科细菌，但CNPt-d灵敏性更强，准确性更高，且无需昂贵的蛋白抽提液，试剂成本价廉，可作为碳青霉烯类非敏感类肠杆菌科细菌的有效筛查方法，应用于临床。