耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的基因组分型及耐药性评估

郑军涛，胡会

（河南省西华第一医院检验科，河南 周口 466600）

肺炎克雷伯菌广泛存在于自然界中，是最为常见的机会致病菌之一，可直接引发多种感染疾病，如菌血症、尿路感染、肝脓肿等[1]。耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌是临床中较为常见的耐药菌，目前尚无有效对应治疗手段，直接导致病死率升高，引发了广泛关注[2]。在耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的传播性调查研究中，全基因组测序技术和基于全基因组序列的分型技术被广泛应用，在菌株鉴别、传播链识别等方面发挥了良好作用[3]。近年来，随着广谱抗菌药物的广泛应用，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药率逐渐提升，给临床对症治疗、预防控制医院感染带来了较大困难，并且对人类健康造成了极大威胁[4]。因此，对于肺炎克雷伯菌的临床感染分布、基因组分型，特别是耐药性分析对临床合理控制其传播显得尤为重要[5]。本研究主要探究耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌院内分布状况、基因组分型情况及耐药性趋势，为临床中合理使用碳青霉烯类抗菌药物提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源及分离鉴定

134株肺炎克雷伯菌株分离自2021年1月—9月本院患者的不重复送检样本，包括痰液、尿液、脓液、血液等，其中共分离出68株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌株。所有肺炎克雷伯菌的培养、分离和鉴定均按照《全国临床检验操作规程》（第4版）[6]进行。

1.2 全基因组测序及分析

使用菌株ZZYF002的基因组序列作为参考序列，使用bowtie2软件将其他菌株的基因组与之比对，使用Samtools软件鉴定所有菌株基因组的共有SNP。将序列比对至耐药基因数据库中，查找耐药性相关基因的名称，挑选分析每株菌的耐药基因，包括blaKPC、blaNDM、blaIMP、blaVIM和blaOXA-48，将每株菌的全基因组序列与MLST网站（http：//bigsdb.pasteur.fr/）公布的肺炎克雷伯菌MLST分型的7个管家基因rpoB、gapA、mdh、pgi、phoE、infB和tonB的片段序列进行比对，获得每个位点的等位基因编号以及菌株的MLST型别。

1.3 药敏方法

采用K-B纸片法药敏试验，通过细菌分析仪观察68株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌株对氨苄西林、头孢他啶、头孢唑林、头孢噻肟、阿米卡星、环丙沙星、庆大霉素、左氧氟沙星、亚胺培南、美罗培南等10种抗菌药物的耐药性，结果根据美国临床实验室标准化研究所2015版标准进行判断。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析。计数资料以（n）和（%）]进行描述。

2 结果

2.1 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株分布

分离的68株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株大部分来源于痰液和尿液标本，分别为69.66%和19.05%；科室分布以重症监护室、呼吸内科为主，具体见表1。

表1 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株分布

2.2 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株的基因分型

基于全基因组序列分析，68株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌MLST分型分为4种不同的型别，其中有65株为ST11型；1株ST219型菌株携带blaNDM-1基因，1株ST11型菌株携带blaKPC-11基因，1株ST11型菌株同时携带blaKPC-2和blaNDM-1基因，其余63株ST11型、1株ST15型和1株ST2237型菌株均携带blaKPC-2基因，未检出blaIMP、blaVIM和blaOXA-48基因，具体见表2。

表2 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株的基因分型

2.3 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株对10种抗菌药物的耐药率分析

68株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株对氨苄西林、头孢他啶、头孢唑林、头孢噻肟耐药率高达95.00%以上，具体见表3。

表3 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株对10种抗菌药物的耐药率分析[n（%）]

3 讨论

ST11型是我国耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌株的主要流行MLST型[7]。我国报道的第1株ST11型耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌株于2007年成功分离[8]。本研究结果显示，携带blaKPC-2基因是ST11型菌株产生碳青霉烯类抗生素耐药性的主要机制，提示携带blaKPC-2基因的ST11型耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌株已经在我国流行了多年。

3.1 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株分布情况

本研究结果显示，分离的68株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株大部分来源于痰液和尿液标本，分别为69.66%和19.05%，科室分布以重症监护室、呼吸内科为主。据此证实耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株在院内各科室中已广泛分布，究其原因是耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株可通过患者间交叉感染、人工呼吸机等医疗器械进行传播，其主要分布在重症监护室、呼吸内科，是因为这些科室的患者病情较为严重，免疫力水平较低、患病时间较长、联合使用了多种抗菌药物等；且以痰液、尿液标本为主，说明其常引起的症状为呼吸道感染、泌尿系感染，与相关文献报道[9]一致。

3.2 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株的基因分型

基于全基因组序列分析，68株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌MLST分型分为4种不同的型别，其中有65株为ST11型；1株ST219型菌株携带blaNDM-1基因，1株ST11型菌株携带blaKPC-11基因，1株ST11型菌株同时携带blaKPC-2和blaNDM-1基因，其余63株ST11型、1株ST15型和1株ST2237型菌株均携带blaKPC-2基因，未检出blaIMP、blaVIM和blaOXA-48基因，与徐慧等[10]研究类似。该结果说明耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌主要以携带blaKPC-2基因进行传播，并且已经开始独立流行传播，医疗机构可以对应发展相关基因组水平技术手段，应用于耐药菌的日常监测，并结合临床诊疗数据，及时采取措施加以防控。

3.3 耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株对10种抗菌药物的耐药率比较

本研究中耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对多种抗菌药物产生耐药，除庆大霉素、左氧氟沙星耐药率低于90.00%外，氨苄西林、头孢他啶、头孢唑林、头孢噻肟耐药率高达95.00%以上，高于相关报道的检出率[11]，其原因可能与不同地区、医院的抗菌用药使用频率有关，同时也说明我院在耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株引起相应感染时的控制工作较差；其次是因为碳青霉烯类抗生素是具有广谱耐药活性的β-内酰胺抗生素，随着碳青霉烯酶的基因分型重合率上升，多重耐药菌株以及泛耐药菌株的数量也逐年上升。

综上所述，携带blaKPC-2基因的ST11型耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株已在院内各科室广泛分布，且对各抗菌药物的耐药率有所增加。因此，应引起临床重视，合理使用抗菌药物。