ACA(+)复发性流产蜕膜基因芯片检测

周 旋*，冯晓玲，周伟达

（1.黑龙江省中医药科学院，黑龙江 哈尔滨 150036； 2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040； 3.黑龙江省第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001）

复发性流产属妇产科疑难杂病，免疫因素在复发性流产中的比例占60.18%[1]主要原因是抗磷脂综合征，而抗心磷脂抗体(ACA)阳性又是引起复发性流产的主要免疫因素。RSA受多条基因控制，本研究应用Agilent Human Gene Expression （4*44K，Design ID：014850）芯片筛选出ACA(+) RSA及正常妊娠人流蜕膜中的差异表达基因，总结并且分析这些差异基因的生物学途径、分子功能、和细胞组件，从基因水平揭示ACA(+) RSA的发病机制。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 ACA(+)RSA组（试验组）

20例；年龄23～36岁，平均（28.7±4.5）岁。

病例来自本院患者，符合WHO的《复发性流产的病名及诊断标准》，且ACA阳性，现妊娠5～8周胚胎停育者。

1.1.2 正常妊娠组（对照组）

20例；年龄21～36岁，平均（27.4±5.7）岁。病例来自本院门诊，有过至少一次成功分娩史，现妊娠5～8周，胚胎正常，要求行人流术者。

分别收取两组患者蜕膜2 g，用冻存管保存至-80℃。

1.2 基因芯片的制备和杂交

首先使用Agilent Bioanalyzer 2100检测样品总RNA质量，合格后通过NanoDrop ND-2000进行定量，然后得到cRNA，最后杂交基因芯片，通过扫描Agilent Scanner G2505C，最终获得原始的图像。整个过程由上海欧易生物医学科技有限公司完成。

1.3 差异基因数据分析

原始数据的处理使用Feature Extraction 软件(version10.7.1.1)，quantile标准化以及后续分析使用Genespring软件(version 12.5)，差异基因筛选根据T检验的p值和倍数变化值Fold change，标准为Fold change值≥2.0且P值≤0.05。对差异基因进行GO和KEGG富集分析以及非监督层次聚类，利用热图的形式展示差异基因在不同样本间的表达模式。

2 结 果

2.1 差异筛选统计

通过计算两组芯片探针的P值和倍数变化值，共筛选出差异表达基因851条，包括234条上调表达基因和617条下调表达基因，其中部分差异表达显著的基因的功能主要与信号转导、细胞粘附、细胞增殖、细胞凋亡、受体结合活性、细胞因子活性及生长因子活性等有关，如 IL-20、PI3K、CD80、TNFRSF1B等基因的表达显著上调，IL19、CXCL5、CXCL3、MMP26等基因的表达则显著下调。

2.2 基因和通路分析

KEGG结果显示见图1，根据差异基因的比例和KEGG数据库相结合得出，ACA(+)RSA早期难免流产与正常早期妊娠妇女相比，主要是以下几个方面出现了差异：细胞因子及其受体之间的相互作用、谷氨酸突触、破骨细胞的分化、蛋白质的消化和吸收、矿物质的吸收、视黄醇的代谢、细胞色素p450的异物代谢、细胞色素p450的药物代谢、细胞外基质受体的相互作用、小细胞肺癌以及胆汁分泌。

接着，根据差异基因在各信号通路上的数量和差异倍数，总结出ACA(+)RSA早期难免流产相关的信号通路一共有5条，分别是TLR4/NF-κB信号通路、依赖性蛋白激酶信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、p53信号通路。

基因芯片研究发现与TLR4/NF-κB信号通路相关的差异基因有4个,与对照组比较ACA(+)RSA早期难免流产组上调的基因有3个，包括TLR4、NF-κB、TNF-ɑ,下调的基因有1个，包括COx2。见图1。

图1 基因芯片KEGG分析

3 讨 论

目前，复发性流产的发病率在临床可见逐年上升，不仅严重危害女性的身心健康，而且大大的影响夫妻感情导致家庭关系不睦[2-3]，所以探究复发性流产的发病机制迫在眉睫，本文从基因水平研究复发性流产的发病机制，筛选出ACA(+)RSA相关的信号通路及差异基因。目前认为ACA导致RSA机制为：ACA 可以和磷脂结合蛋白相结合，降低抗凝的活性[4]，影响血管内皮细胞[5]，干扰抗凝系统[6]，最终促使免疫平衡紊乱，促使血管内血栓形成。随着胎盘血管血栓形成的加重，导致子宫内膜血流异常[7]，进而引起胎盘血流异常，导致胎盘梗死、形成缺陷以及慢性炎症等，最终损伤胎盘功能，导致流产。

本研究通过基因芯片检测发现TLR4及其信号传导途径在抗体介导的ACA血栓形成机制中扮演着重要的角色。在免疫领域中妊娠免疫较为特殊，有研究提出在妊娠时，TLR4在非特异性免疫中发挥着重要作用，此时炎性细胞因子增强非特异性免疫[8]。实验表明存在于抗磷脂抗体综合征血清的高表达的抗磷脂抗体（antiphospholipid antibody,aPL）和他的病理机制关系很大，而aPL的重要靶抗原则是β2糖蛋白I（beta-2-glycoprotein I,β2GPI)。有研究表明β2GPI抗体广泛存在于反复患血栓性疾病的患者，而来自于亲和纯化的抗磷脂抗体综合征患者的抗β2GPI抗体可以促进小鼠的血栓产生[9]。有研究[10]表明，LPS能使内皮细胞被激活，它和β2GPI拥有同样的信号通路，当内皮细胞绑定了β2GPI抗体抗原复合物后，能够激活TLR4，进而激活TLR4/NF-κB信号通路。

本实验通过基因芯片技术筛查出TLR4是抗心磷脂抗体阳性复发性流产早期难免流产和正常早期妊娠间的差异基因，推测其可能是参与诱抗心磷脂抗体阳性复发性流产早期难免流产的重要基因。