基于多指标抗炎活性检测的注射用血塞通生物评价方法研究

马湘炜蒋淑敏赵筱萍

1.浙江中医药大学药学院 杭州 310053 2.浙江中医药大学基础医学院

注射用血塞通（冻干）（简称血塞通，Xuesaitong injection，XST），是由五加科人参属植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的根茎提取物经加工制成的冻干粉针剂，主要成分为三七总皂苷，临床上主要用于脑梗死、心肌梗塞、动脉粥样硬化等疾病的治疗[1-3]。目前血塞通质量控制主要是采用指纹图谱以及高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography,HPLC）含量检测等方法[4-5]，但是单纯的化学分析方法只能检测主要化学成分的含量波动，与其生物活性的相关性较低，难以有效保障临床安全性与有效性[6]。因此，有必要建立与血塞通药效相关的生物活性检测方法，从而综合评价其稳定性。

课题组前期研究表明，抗炎以及抗血小板聚集是血塞通抗大鼠脑缺血再灌注损伤的主要途径[7]；基于网络药理学手段研究发现肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、一氧化氮合酶（induced NOS，iNOS）可能是血塞通抗大鼠心肌梗死的潜在靶点，进一步验证发现人参皂苷Rb1、三七皂苷R1、人参皂苷Rd 能够显著性下调脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激后RAW 264.7巨噬细胞iNOS蛋白表达[8]。因此，本研究以抗炎活性为指标，采用LPS刺激骨髓来源巨噬细胞向M1型极化，以M1型巨噬细胞为细胞模型，检测不同批次血塞通对一氧化氮（nitric oxide，NO）以及炎性细胞因子白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、高迁移率族蛋白 B1（high mobility group box 1，HMGB1）分泌量的影响，通过比较正常批次与异常批次血塞通抗炎活性的差异，初步构建其生物活性评价标准，提供一种新的血塞通批次间一致性评价方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 无特定病原体（specific pathogen free,SPF）级 C57BL/6 小鼠，雌性，6～8 周，体质量 18～20g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[动物许可证号码：SCXK（沪）2017-0005]。

1.1.2 试剂与药物 LPS、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)购自美国Sigma公司（批号：043M4104V、STBH3607）,RPMI 1640 培养基、Penicillin Streptomycin双抗购自美国Corning公司（批号：05118006、30002283），胎牛血清购自美国Gibco公司（批号：1914728），氯化铵溶液购自加拿大Stemcell Tech公司（批号：17H83563），重组小鼠巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor,M-CSF）购自美国PeproTech公司（批号：0817245）,三七皂苷R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Re、人参皂苷 Rb1、人参皂苷Rd购自上海融禾医药科技发展有限公司（批号：120821、150823、120723、120120、120507）, 无水乙醇购自上海凌峰化学试剂有限公司（批号：20181112）,一氧化氮检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司（批号：S0021）,小鼠HMGB1酶联免疫吸附测定试剂盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司（批号：L3L29SEKUA）,小鼠IL-6酶联免疫检测试剂盒购自美国Invitrogen公司（批号：193843003）,不同批次注射用血塞通（冻干）由哈尔滨珍宝制药有限公司提供。

1.1.3 仪器 高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司，型号：Centrifuge5810/5810R）,Infinite M1000pro多功能酶标仪（瑞士Tecan公司，型号：M1000pro）,Count-Less自动细胞计数仪（美国Invitrogen公司，型号：10082-056）,细胞培养箱（美国Thermo公司，型号：3111），超净工作台（美国Thermo公司，型号：1300 Series A2）。

1.1.4 血塞通异常批次制备 异常批次采用血塞通中5个主要单体化合物储备液按一定含量比例配制而成。异常批次1～4中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Re按血塞通正常批次中单体含量比例（分别为10.85%、38.11%和5.16%）配制，人参皂苷Rb1及人参皂苷Rd的含量比例分别为：异常批次1不含人参皂苷Rb1及人参皂苷Rd；异常批次2人参皂苷Rb1含量为5%，人参皂苷Rd含量为0.5%；异常批次3人参皂苷Rb1含量为10%，人参皂苷Rd含量为1%；异常批次4人参皂苷Rb1含量为20%，人参皂苷Rd含量为2%。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠骨髓细胞的提取及骨髓来源巨噬细胞的诱导分化 取6～8周、18g左右的C57BL/6小鼠脱颈处死后浸泡在75%酒精中消毒，在无菌超净工作台内取出完整的小鼠股骨和胫骨，置于含RPMI-1640培养基的培养皿内。用1mL注射器的针头在股骨和胫骨两端打孔并吹打骨髓腔，将其骨髓内的细胞冲至RPMI-1640完全培养液中，收集于50mL离心管中，4℃，1500rpm离心10min。弃上清液，在细胞沉淀中加入氯化铵溶液裂解红细胞1min，加入等量的RPMI-1640完全培养液，4℃，1500rpm离心10min，弃上清液。用含10ng·mL-1M-CSF的促分化RPMI-1640完全培养液重悬细胞，以8×106个/孔细胞密度种于12孔板，置于5%CO2，37℃条件下培养，于第4天换液，第7天得到诱导成熟的骨髓来源巨噬细胞。

1.2.2 血塞通抗炎活性量效关系考察 从培养箱中取出含有成熟骨髓来源巨噬细胞的12孔板，弃去每孔培养液，磷酸盐缓冲液（posphate buffered saline,PBS）漂洗一遍备用。实验分为3组，分别为对照组、模型组以及给药组。对照组加入1mL RPMI-1640完全培养液；模型组加入1mL含100ng·mL-1LPS的RPMI-1640完全培养液；给药组加入1mL含不同浓度血塞通（400、300、200μg·mL-1） 及 100ng·mL-1LPS 的RPMI-1640完全培养液。置于细胞培养箱中继续培养24h，吸取每孔细胞上清液，离心后收集上清液用于检测NO、IL-6以及 HMGB1含量。

抑制率（%）=（模型组含量-给药组含量）/（模型组含量-对照组含量）×100%。

1.2.3 血塞通主要成分抗炎活性检测 采用1.2.2的方法考察血塞通5个主要成分三七皂苷R1（200μmol·L-1）、人参皂苷Rg1（200μmol·L-1）、人参皂苷Re（200μmol·L-1）、人参皂苷Rb1（200μmol·L-1）、人参皂苷Rd（100μmol·L-1）对M1型巨噬细胞释放NO、IL-6以及 HMGB1的抑制作用。

1.2.4 不同批次血塞通抗炎活性检测 采用1.2.2的方法考察24个正常批次及4个异常批次血塞通（400μg·mL-1） 对 M1 型巨噬细胞释放 NO、IL-6 以及HMGB1的抑制作用。

1.2.5 NO、IL-6及HMGB1含量的检测方法 用RPMI-1640完全培养液稀释1mol·L-1NaNO2标准品，选取 0、1、2、5、10、20、40、60、100μmol·L-1浓度作为标准曲线浓度梯度。吸取100μL/孔细胞上清液样品及不同浓度标准品于96孔板中，每个样品作三复孔。室温避光条件下，各孔分别加入50μL Griess ReagentⅠ和50μL Griess ReagentⅡ，然后在540nm处测定吸光度。根据不同浓度标准品显色后测得的吸光度为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算不同样品中NO含量。IL-6及HMGB1含量按照酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immune-sorbent assay，ELISA）试剂盒说明书所述方法进行检测。

1.3 统计学方法 实验数据以均数±标准差(standard difference,SD)（mean±SD）表示，采用Graphpad Prism 7软件进行数据处理及作图，用T-Test检验分析，P＜0.05表示组间具有差异。采用Simca 14.1软件绘制三维散点图。所有实验均重复3次。

2 结果

2.1 血塞通抗炎活性量效关系 与对照组相比，LPS刺激24h后模型组M1型巨噬细胞NO、IL-6以及HMGB1 分泌量显著增加（P＜0.01，P＜0.05，P＜0.01），表明该模型可用于抗炎活性评价。见图1。血塞通可抑制M1型巨噬细胞NO、IL-6以及HMGB1的分泌，且在200至400μg·mL-1浓度范围内抑制率呈现剂量依赖性关系。见图2。

图1 M1型巨噬细胞NO、IL-6以及HMGB1的分泌量Fig.1 Secretions of NO,IL-6 and HMGB1 in M1 macrophages

图2 不同浓度血塞通对M1型巨噬细胞NO、IL-6及HMGB1分泌的抑制作用Fig.2 Dose-dependent inhibitions of XST on the secretions of NO,IL-6 and HMGB1 in M1 macrophages

2.2 血塞通主要成分对M1型巨噬细胞NO、IL-6及HMGB1分泌的抑制作用 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷 Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd是血塞通主要成分。运用上述评价模型研究5个主要化合物的抗炎活性，结果表明人参皂苷Rb1及人参皂苷Rd具有较好的抗炎活性。其中，人参皂苷Rb1及人参皂苷Rd对M1型巨噬细胞NO及IL-6分泌具有较高的抑制作用，但对HMGB1分泌的抑制作用相对较弱。见图3。

图3 血塞通主要成分对M1型巨噬细胞NO、IL-6以及HMGB1分泌的抑制作用Fig.3 The inhibitions of major components in XST on the secretions of NO,IL-6 and HMGB1 in M1 macrophages

2.3 不同批次血塞通对M1型巨噬细胞NO、IL-6及HMGB1分泌的抑制作用 采用上述评价模型分别考察24个正常批次与4个异常批次血塞通样品的抗炎活性。结果表明，其对炎性因子IL-6、HMGB1分泌的抑制作用具有明显差异。其中，正常批次对NO、IL-6及HMGB1抑制率平均值分别为（75.47±7.68）%、（78.34±8.07）%、（45.84±8.45）%，异常批次对 NO、IL-6及HMGB1抑制率平均值分别为（31.87±18.15）%、（16.06±11.99）%、（-9.24±3.90）%。见表 1。结合多指标三维散点图发现，正常批次与异常批次具有较明显区分，且正常批次分布较为密集，而异常批次分布相对比较散乱。见图4。

图4 正常及异常批次血塞通的多指标评价Fig.4 The evaluation of normal and abnormal batches of XST by multi-indicators

表1 24个正常批次与4个异常批次血塞通对M1型巨噬细胞NO、IL-6及HMGB1分泌的抑制率（±s，%）Tab.1 The inhibitions rates of 24 normal batches and 4 abnormal batches of XST on the secretions of NO,IL-6 and HMGB1 in M1 macrophages（±s，%）

表1 24个正常批次与4个异常批次血塞通对M1型巨噬细胞NO、IL-6及HMGB1分泌的抑制率（±s，%）Tab.1 The inhibitions rates of 24 normal batches and 4 abnormal batches of XST on the secretions of NO,IL-6 and HMGB1 in M1 macrophages（±s，%）

批次正常批次异常批次批号 抑制率（%）NO IL-6 HMGB1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 1 2 3 4 86.67±6.66 82.03±3.79 70.34±8.34 73.38±4.62 83.03±4.78 80.61±12.51 76.48±10.15 73.31±6.02 76.65±5.09 80.00±1.27 75.20±1.05 67.59±8.87 69.08±6.54 75.43±4.50 85.27±5.78 69.61±9.32 85.03±3.79 86.41±2.43 76.17±10.10 78.98±7.66 66.26±15.49 74.16±18.18 62.04±15.52 57.49±20.47 20.92±10.50 12.93±17.98 41.22±4.16 52.41±15.03 85.03±9.36 90.40±8.82 80.97±3.28 87.64±11.96 88.80±4.17 78.95±4.10 74.48±4.15 74.26±9.43 72.64±12.52 81.20±4.74 74.17±13.84 70.84±13.14 61.75±19.27 85.88±8.66 81.30±9.84 76.17±10.80 88.24±26.92 88.82±18.21 65.73±16.07 78.33±9.73 67.29±17.60 82.75±3.91 76.09±14.00 68.45±11.41 4.30±18.25 8.63±17.84 20.44±17.28 30.84±11.87 58.94±14.06 60.56±6.43 52.11±10.53 46.38±8.67 48.37±13.67 47.34±10.96 47.98±1.82 50.55±14.20 43.38±14.19 46.05±7.79 41.65±12.38 39.05±13.81 52.51±26.40 47.78±15.27 53.34±10.95 42.58±8.29 36.57±31.04 46.18±6.18 51.50±4.24 51.82±6.63 29.55±8.99 43.87±13.25 39.27±11.50 22.85±14.06-13.28±17.98-11.63±15.31-7.20±15.86-4.84±15.17

2.4 血塞通批次间一致性的生物活性评价标准研究为了建立血塞通生物活性评价标准，通过计算24个正常批次在不同抗炎活性指标下抑制率的均值和标准差，绘制生物活性控制限图。由图可知，正常批次与异常批次NO、IL-6、HMGB1抑制率存在显著差异（P＜0.01）。以均值加减3倍标准差评判血塞通正常样品批次间一致性，发现正常批次全部符合标准，而异常批次均超出标准的控制限。由此，初步确定血塞通抗炎活性评价标准，采用小鼠骨髓来源M1型巨噬细胞模型，和血塞通样品孵育24h后检测NO、IL-6以及HMGB1的分泌量，反映抗炎活性的3个指标抑制率的控制限分别为52.42%～98.52%、54.14%～102.54%及20.49%～71.20%。见图5。

3 讨论

生物评价方法具有与中药药理作用、临床功效相关联等优点，已逐渐成为中药质量控制及评价的重要发展方向之一[9]。目前已有研究者采用生物检测方法建立少数几个中成药品种的生物评价方法，例如血栓通胶囊抑制血小板聚集活性检测[10]，大黄配方颗粒致泻生物效价检测[11]，丹红注射液抗氧化损伤能力检测[12]等方法。但目前血塞通生物评价方法尚未有文献报道。据此，本研究基于血塞通抗炎活性检测，建立一种多指标的生物评价方法。

图5 血塞通一致性评价的生物活性控制限图Fig.5 Bioactivity control chart for batch-to-batch consistency evaluation of XST

本研究提取小鼠骨髓细胞，在M-CSF诱导下形成成熟的骨髓来源巨噬细胞，使用LPS刺激骨髓来源巨噬细胞向M1型极化，产生炎症反应。骨髓来源的巨噬细胞，虽然操作复杂，但相比细胞株更接近体内生长特性，更适宜用于药物的生物活性评价。研究表明巨噬细胞受LPS刺激后分泌TNF-α、IL-6等促炎性因子以及炎症介质iNOS等[13]。iNOS是NOS的同工酶，被激活后能产生大量的NO，作为炎症发生的重要标志[14]。IL-6是关键的促炎细胞因子，在炎症初始阶段合成后，快速诱导广泛的急性期蛋白产生[15-16]。HMGB1是一种非组蛋白核蛋白，与炎症性疾病如脓毒症、关节炎以及由炎症诱发的相关疾病如动脉粥样硬化等密切相关[17-19]。炎症反应是脑梗和心肌梗死重要的病理过程，研究表明脑梗和心肌梗死患者血清中NO、IL-6、HMGB1含量增加[20-24]。因此本研究选择NO、IL-6、HMGB1这3个经典的炎症指标，用于血塞通抗炎生物评价。

结果表明，血塞通能够剂量依赖性地降低M1型巨噬细胞NO、IL-6以及HMGB1的分泌量，其中血塞通对NO及IL-6的抑制率明显高于HMGB1。三七皂苷 R1、人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Re、人参皂苷 Rb1、人参皂苷Rd是血塞通主要成分，占总含量的85%以上。这5个成分的抗炎活性检测结果表明人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd是血塞通抗炎主要活性物质。人参皂苷Rb1及人参皂苷Rd对M1型巨噬细胞NO、IL-6分泌具有较强的抑制作用，但对HMGB1抑制率相对较弱，这可能是引起血塞通对HMGB1抑制作用较弱的原因。为进一步探究上述检测方法能否有效区分血塞通正常批次与异常批次，本研究通过调整5个主要成分的比例，配置了人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd含量比例异常的样品，模拟血塞通生产过程波动产生的异常批次。4个异常批次中，人参皂苷Rb1及人参皂苷Rd含量比例分别为20%/2%、10%/1%、5%/0.5%及0%/0%，显著低于血塞通药品标准中规定的含量比例（人参皂苷Rb1含量应为标示量的26%～40%、人参皂苷Rd应为标示量的3.5%～12%）。将24个正常批次及4个异常批次血塞通进行抗炎活性检测，发现正常批次抑制率平均值远高于异常批次，表明正常批次与异常批次血塞通对M1型巨噬细胞NO、IL-6、HMGB1分泌的抑制作用均具有明显差异。为更加全面评价不同批次血塞通抗炎活性，采用多指标对正常及异常批次进行比较，结果显示多指标评价对血塞通正常批次及异常批次具有非常直观的区分效果。

为建立血塞通生物活性评价标准，以均值±3倍标准差作为上下限绘制生物活性控制限图，以评价不同批次间的一致性和差异性[25]，结果显示24个正常批次血塞通均位于控制限内，异常批次均超出控制限范围，进一步证明了方法的可靠性。

本研究提供了一种基于多指标抗炎活性检测的血塞通批次间一致性评价新方法，建立了与临床疗效相关联的血塞通生物评价方法，初步建立了血塞通抗炎活性评价标准，为血塞通批次间一致性评价提供了新途径。