血清磷脂酶A2组ⅡA和凝血因子Ⅸ筛查耐多药肺结核病气阴两虚证的应用研究

胡玉婷温成平江婷婷范永升李继承,3

1.华南理工大学医学院 广州 510006 2.浙江中医药大学 3.浙江大学

耐多药肺结核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）是结核分枝杆菌（M.tuberculosis，Mtb.）感染引起的、至少对异烟肼和利福平两种药效最强的一线抗结核药物耐药的结核病[1]。仅2016年全球就有49万例MDR-TB新发病例和约24万例死亡病例[1]。MDR-TB的传统二线治疗方案存在严重缺陷，包括治疗周期长、不良反应严重等，导致患者耐受性差，死亡率增加[1-3]，因此，迫切需要控制MDR-TB治疗药物的不良反应，以提高疗效[2]。

研究已证实，中医药具有减轻抗结核药物不良反应、增强患者免疫力和抑制Mtb.生长等作用，治疗普通肺结核病和MDR-TB的疗效显著[4-7]。中医在“辨证施治”的原则下，根据MDR-TB证候的不同来选择不同药物进行治疗。MDR-TB证候一般分为肺阴虚（pulmonary Yin deficiency，PYD）证、阴虚火旺（hyperactivity of fire due to Yin deficiency，HFYD） 证、气阴两虚（deficiency of Qi and Yin，DQY）证和阴阳两虚（deficiency of Yin and Yang，DYY）证，其中 DQY证患者最多[8-12]。然而，由于MDR-TB证候分类缺乏分子生物学基础，导致其证候分类不够准确，从而在一定程度上影响了中医治疗MDR-TB的疗效，因此需要建立MDR-TB中医证候诊断的客观标准[13-17]。由于DQY证患者人数在MDR-TB四种证候中最多，控制MDR-TB DQY证的病情对控制MDR-TB的疫情十分重要，因此急需建立MDR-TB DQY证诊断的客观标准。

磷脂酶A2组ⅡA（phospholipase A2 groupⅡA，PLA2G2A）是磷脂酶 A2（phospholipase A2，PLA2）家族成员，不仅可释放游离脂肪酸和溶血磷脂，影响机体脂肪酸含量，其表达水平还与炎性疾病的严重程度相关[18]。凝血因子Ⅸ（coagulation factor Ⅸ，F9）是维生素K依赖性血浆蛋白，参与血液凝固的内源性途径。有研究证实，宿主体内的脂肪酸是Mtb.的碳源和能量来源之一，脂肪酸对Mtb.在宿主体内的持续存在和耐药性产生有重要作用，提示MDR-TB的发生、发展与宿主脂质代谢密切相关[19-21]。临床上MDR-TB不同证候的患者不仅存在程度不同的慢性炎症反应，而且还存在不同程度的凝血功能紊乱，提示MDR-TB DQY证的生物学基础可能与PLA2G2A和F9的表达密切相关。因此，本研究将采用ELISA法，探索血清PLA2G2A、F9与MDR-TB DQY证的关系，以及PLA2G2A和F9作为MDR-TB DQY证潜在生物学标志物的可能性，以期阐明MDR-TB DQY证的生物学基础，为MDR-TB DQY证的临床诊断提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 一般资料 收集2013年4月至2018年4月在绍兴市立医院中医科和嘉兴市第一医院结核科病房及门诊就诊的MDR-TB患者共88例，其中MDR-TB PYD证患者21例、MDR-TB HFYD证患者29例、MDR-TB DQY证患者37例、MDR-TB DYY证患者1例。由于DYY证候是MDR-TB患者濒临死亡的阶段，样本不易取得，故本研究只对MDR-TB PYD证、HFYD证、DQY证进行研究。应用随机数字表法从上述21例PYD证患者、29例HFYD证患者和37例DQY证患者中各随机挑选出15例MDR-TB患者，分别作为MDR-TB PYD证组、MDR-TB HFYD证组和MDR-TB DQY证组。此外，收集浙江医院2017年3月体验的健康人群30例，并应用随机数字表法随机选取15例作为健康对照（healthy control，HC）组。各组研究对象一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经浙江大学医学部伦理委员会批准，所有受试者在抽血前均获得书面知情同意，研究中使用的所有方法均遵循批准的指导方针和规定。

1.2 纳入和排除标准 本研究纳入和排除标准参照卫生部发布的《肺结核诊断标准》[22]和WHO修订的国际结核病控制条例[23]，所有MDR-TB患者都符合以下诊断标准：（1）确诊为肺结核病；（2）药敏试验确认对异烟肼和利福平两种一线抗结核药物耐药。同时排除患有恶性肿瘤、自身免疫性疾病、重要器官和系统慢性器质性疾病或合并艾滋病毒感染等感染性疾病的MDR-TB患者。根据中华人民共和国中医药行业标准《中医病证诊断疗效标准》[24]中肺痨的中医疾病诊断标准和证候分类诊断标准，所有MDR-TB患者均经中医辨证，分别符合PYD证、HFYD证、DQY证和DYY证，具体证候详见《中医病证诊断疗效标准》中的肺痨证候诊断部分。

1.3 ELISA检测受试者血清中PLA2G2A和F9的蛋白浓度 采用ELISA法分别定量检测各组受试者血清中PLA2G2A和F9的蛋白浓度。PLA2G2A（人）ELISA试剂盒购于美国RayBiotech公司（货号：ELHPLA2G2A），稀释倍数1:10；F9（人）ELISA试剂盒购于美国Abcam公司（货号：ab108831），稀释倍数1:400。以上试剂盒用于测定45例MDR-TB患者（15例PYD证、15例HFYD证和15例DQY证）和15例HC受试者血清PLA2G2A和F9蛋白浓度的变化，运用酶标仪（美国Bio-Rad公司产品）在450nm波长下检测，具体操作依据试剂盒操作手册进行。

1.4 统计学分析 采用SPSS 18.0和GraphPad Prism 7统计软件进行统计学分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析及事后Dunnett多重比较测试（Dunnett's multiple comparisons test）。计数资料以率表示,组间比较采用χ2检验。用MedCalc Version 12.4.2.0软件绘制受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC） 曲线，ROC 曲线指标包括灵敏度（sensitivity）、特异度（specificity）、曲线下面积（area under the ROC curve，AUC），用以评估每个潜在生物学标志物的诊断准确性。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同证候MDR-TB患者一般资料比较 88例MDR-TB患者中DQY证的患者数最多，其次是HFYD证，再者是DQY证，而DYY证患者最少，各证候间年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 各组受试者临床资料比较 各组受试者的年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 不同证候MDR-TB患者一般资料比较

表2 各组受试者一般资料比较

与 HFYD证组比较，DQY证组血尿酸（uric acid，UA）水平显著下调，差异具有统计学意义（P=0.014）。与PYD证组比较，DQY证组纤维蛋白原（fibrinogen，FIB）和免疫球蛋白 G（immunoglobulin G，IgG）水平均显著上调，差异具有统计学意义（P=0.003，P=0.048）。见表 3。

表3 各组受试者血生化指标比较

2.3 各组受试者血清F9和PLA2G2A表达比较 各组受试者F9的蛋白浓度存在统计学差异（P＜0.05），进一步比较发现，HC组明显低于其他3组，差异有统计学意义（P＜0.0001），且DQY证组的蛋白浓度明显低于HFYD证组（P＜0.05）。各组受试者血清PLA2G2A的蛋白浓度存在统计学差异（P＜0.05），DQY证组PLA2G2A的蛋白浓度明显高于PYD证组、HFYD证组和HC组，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见表 4、图 1。

2.4 MDR-TB DQY证潜在生物学标志物的ROC分析 为了研究F9和PLA2G2A诊断MDR-TB DQY证的效果，以ROC曲线评估其AUC、灵敏度和特异度。将MDR-TB DQY证组的诊断指标设为1，MDRTB PYD证组、MDR-TB HFYD证组和HC组分别均设为0。结果显示，PLA2G2A分别用于鉴别MDR-TB DQY证和PYD证、MDR-TB DQY证和HFYD证，以及MDR-TB DQY证和HC的准确性一般，而F9鉴别MDR-TB DQY证和HFYD证、MDR-TB DQY证和HC的准确性较好。见表5-6、图2。

3 讨论

肺结核病是中国第二大传染病。由于中国部分地区人口密度高，卫生条件较差，因此不管是药物敏感性肺结核病还是MDR-TB的发病人数均较多[1,25-27]。从全球范围看，MDR-TB同样也是一项公共卫生安全问题，因为与普通肺结核病患者相比，MDR-TB患者对药物的耐受性更差，生存期更短，死亡率更高[2,28-29]。中医根据MDR-TB的不同证候，选择与证候对应的药物对MDR-TB进行针对性治疗，可获得良好的治疗效果[6,30]。

表4 各组受试者血清F9和PLA2G2A表达比较

图1 各组受试者血清F9和PLA2G2A表达比较

表5 血清PLA2G2A鉴别诊断MDR-TB DQY证的ROC分析

表6 血清F9鉴别诊断MDR-TB DQY证的ROC分析

MDR-TB DQY证的病机为机体元气不足，阴伤气耗，导致肺脾两虚[31]。肺脾同病，阴伤气耗，清肃失司，肺不主气而为咳，气不化津而成痰，肺虚络损则痰中带血，气虚不能卫外，阳陷入阴，故见气虚身热、怕风、自汗；阴虚则内热、盗汗；脾虚不健则食少、便溏；气阴两伤故面白颧红、舌质嫩红、脉细弱而数[32-33]。MDRTB DQY证的治法以益气、养阴为主，常用保真汤治疗。临床上，由于MDR-TB患者病程较长,且病情迁延不愈,导致患者以DQY证为主,其次是HFYD证,而最少的则是PYD证，这与本研究发现一致。

本实验进一步研究了临床生化指标与MDR-TB DQY证型之间的相关性，结果表明，与PYD证患者相比，DQY证患者血液中FIB和IgG水平更高。FIB和IgG与凝血和炎症反应相关[34-35]，提示DQY证患者凝血功能紊乱、炎症反应活跃。本实验结果显示，PLA2G2A在MDR-TB DQY证中高表达。PLA2G2A是PLA2家族的成员，是一种低分子量并需要钙离子催化的细胞外酶，能催化磷酸甘油酯的sn-2脂肪酸酰基酯键水解，释放游离脂肪酸和溶血磷脂，影响机体脂肪酸含量。PLA2G2A在MDR-TB DQY证中高表达，提示MDR-TB DQY证患者体内脂肪酸含量可能发生上调，而脂肪酸是Mtb.合成自身细胞膜脂质的主要碳源和能量来源[19-20]，脂肪酸含量上调不仅可以保护Mtb.免受抗结核药物和宿主炎性细胞因子的影响，而且还可以促进Mtb.在体内持续存在和传播[16-21]。同时，PLA2G2A被称为“炎性sPLA2”、在炎性刺激作用下其表达显著上调，与炎性疾病的严重程度相关，这提示PLA2G2A水平可能与MDR-TB DQY证患者表现出的炎症反应程度有关[18]。本研究结果显示DQY证患者的PLA2G2A水平最高，提示其炎症反应程度最强。然而，DQY证虽被认为是MDR-TB病情较严重的证型，其患者通常表现为咳嗽无力、气短声低、神疲乏力等消耗性症状，一般情况下其炎症反应程度却弱于HFYD证。因此，PLA2G2A的水平与炎症反应程度的关系值得进一步研究。此外，该实验结果也进一步提示PLA2G2A在DQY证中过度表达可能与其他原因有关，这也值得进一步研究。

图2 血清PLA2G2A和F9鉴别诊断MDR-TB DQY证的ROC分析

本实验还发现，MDR-TB DQY证中F9表达低于HFYD证，提示DQY证患者凝血功能与HFYD证不同。F9是维生素K依赖性凝血因子，其作为无活性的酶原在血液中循环。它的活化形式F9a通过与Ca2+离子、膜磷脂和F8的相互作用将F10活化为其活性形式F10a，从而参与血液凝固的内源性途径，调节机体凝血反应。临床上，MDR-TB DQY证患者表现为痰中偶带血，血色淡红，而HFYD证患者表现为时时咯血，且血色鲜红[31-33]，提示MDR-TB DQY证和HFYD证凝血功能确有不同，而F9表达差异可能与MDR-TB HFYD证患者咯血量多导致的机体代偿有关。

本实验以ROC曲线评估了PLA2G2A和F9作为MDR-TB DQY证潜在生物学标志物的准确性，结果显示PLA2G2A鉴别MDR-TB DQY证和PYD证、鉴别MDR-TB DQY证和HFYD证、鉴别MDR-TB DQY证和HC的AUC在均0.6～0.7之间，说明其诊断准确性一般，而F9虽然能良好地鉴别MDR-TB DQY证与HFYD证和HC，但却不能鉴别DQY证和PYD证。PLA2G2A和F9诊断MDR-TB DQY证的准确性均不是很高，其原因可能与本实验样本量较小，以及人体的个体生理差异较大有关，后续可通过加大样本量，以提高其准确性。

综上所述，本研究提示PLA2G2A可以作为一种新的潜在生物学标志物，应用于MDR-TB DQY证的初步筛查；F9在MDR-TB DQY证的表达量低于HFYD证，与MDR-TB凝血功能异常有关。该研究不仅为MDR-TB DQY证的诊断提供了生物学依据，而且也为研究中医证候的客观分类提供了实验室依据和科学方法，对量化中医证候、实现中医证候现代化具有重要意义。