HPLC-DAD-ESI-TOF／MS 法分析安神补脑液中化学成分

程素盼， 张敏敏， 梁 琰， 张贵民， 苏瑞强， 耿岩玲， 王 晓∗， 赵恒强∗

[1. 山东中医药大学药学院， 山东 济南250355； 2. 齐鲁工业大学（山东省科学院）， 山东省分析测试中心， 山东省中药质量控制技术重点实验室， 山东 济南250014； 3. 山东农业大学食品科学与工程学院，山东 泰安271018； 4. 鲁南制药集团股份有限公司， 中药制药共性技术国家重点实验室， 山东省中药制药新技术重点实验室， 山东 临沂276006］

安神补脑液由淫羊藿、 制何首乌、 鹿茸、 干姜、 甘草、 大枣、 维生素B1 通过现代工艺精制而成， 具有安神健脑、 生精补髓、 益气养血的功效，临床上常用于治疗肾精不足、 气血两亏所致头晕、乏力、 健忘、 失眠、 神经衰弱等症状[1-3］， 2015 版《中国药典》 一部采用HPLC 法测定淫羊藿中淫羊藿苷、 西药维生素B1 的含有量来对其进行质量控制[3］， 也有一些报道采用相同方法测定其中1、 2种成分的含有量[4-9］。 但安神补脑液为中药复方制剂， 是通过多味中药中活性成分的协同作用来发挥药效， 上述方法并不能全面反映其整体质量。

近年来， 色谱与质谱联用技术发展迅速， 因其分离度好、 灵敏度高、 分析周期短等优点被广泛应用于中药复方制剂的检测分析， 特别是高分辨飞行时间（TOF／MS） 质谱技术能给出化合物的精确分子量信息， 从而进一步推断出分子式， 可在没有对照品的情况下结合参考文献和数据库等进行初步鉴别[10］。 因此， 本实验建立高效液相色谱-二极管阵列检测器-电喷雾飞行时间质谱（HPLC-DAD-ESITOF／MS） 法[11-14］分析安神补脑液中化学成分。

1 材料

1.1 仪器 华谱S6000 高效液相色谱仪， 配置自动进样器、 四元泵、 柱温箱、 二极管阵列检测器；Agilent 6520 Q-TOF 液质联用仪 （美国Agilent Technologies 公司）； 电子分析天平（十万分之一，德国Sartourius 公司）； SB-5200D 高功率数控超声波仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 试药 维生素B1 （批号SLBG9 093 V）、 甘草苷（批号P25J7F18328）、 2， 3， 5， 4′-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷（批号P25D5S1）、 淫羊藿苷（ 批 号 T09N6B5664 ）、 大 黄 素 （ 批 号P19A7F13264） 对照品（含有量大于98%， 上海源叶生物科技有限公司）； 次黄嘌呤 （批号F20100102） 对照品（含有量大于98%， 国药集团化学试剂有限公司）； 甘草酸、 6-姜辣素（自制，含有量大于98%）。 安神补脑液（鲁南厚普有限公司生产） 于2016 年购自济南市各大药店， 批号07115003、 00816047、 00815055、 00816028、07115006、 07115019、 00816002、 00816123、00816103、 00816058， 编号S1 ～S10。 乙腈为色谱纯（美国Fisher Scientific 公司）； 甲醇为色谱纯（山东禹王实业有限公司化工分公司）； 甲酸为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）； 无水乙醇为分析纯（天津市广成化学试剂有限公司）； 水为密理博超纯水（18 MΩ）。

2 方法与结果

2.1 成分分析

2.1.1 供试品溶液制备 取适量安神补脑液（编号S1） 摇匀， 过0.22 μm 微孔滤膜， 即得。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取维生素B1、 次黄嘌呤、 甘草苷、 二苯乙烯苷、 淫羊藿苷、 甘草酸、 6-姜辣素、 大黄素对照品各1.0 mg， 置于1 mL量瓶中， 甲醇定容至刻度， 配成1 mg／mL 贮备液，各精密吸取适量于2 mL 量瓶中， 甲醇定容至刻度，制成含500 μg／mL 维生素B1、 100 μg／mL次黄嘌呤、 200 μg／mL 甘草苷、 200 μg／mL 二苯乙烯苷、300 μg／mL 淫 羊 藿 苷、 100 μg／mL 甘 草 酸、100 μg／mL 6-姜辣素、 100 μg／mL 大黄素的溶液，即得。

2.1.3 阴性样品溶液制备 按处方比例及2015 版《中国药典》 一部规定的工艺， 分别制备缺维生素B1、 淫羊藿、 制何首乌、 鹿茸、 甘草、 干姜的阴性样品， 按“2.1.1” 项下方法制备， 即得。

2.1.4 色谱条件 Waters XELECTTM HSS T3 色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）； 流动相乙腈（A） -0.4%甲酸 （B）， 梯度洗脱， 程序见表1； 柱温25 ℃； 检测波长278 nm； 进样量10 μL。 色谱图见图1。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.5 质谱条件 流动相采用三通分流至0.4 mL／min； 电喷雾正、 负离子模式； 全扫描范围m／z 100～1 000； 毛细管电压4.0 kV； 喷雾气压310.28 kPa； 干燥气体积流量10.0 L／min， 温度325 ℃； 裂解电压100 V； 锥孔电压60 V。

2.1.6 ESI-TOF／MS 鉴别 采用ESI-TOF／MS 技术对各成分色谱峰峰进行鉴别， 根据其精确分子量信息、 DAD 检测器所得紫外吸收信息、 前期相关文献、 中国科学院上海有机化学研究所化学专业数据库来进行鉴别， 推断出可能的分子式， 并与相应对照品进行比较以保证准确性。 结果见表2。

2.2 含有量测定

2.2.1 线性关系考察 将“2.1.2” 项下对照品溶液稀释成不同质量浓度， 在“2.1.4” 项色谱条件下进样测定。 以成分质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y） 进行回归， 然后将溶液稀释至低质量浓度， 以3 倍信噪比为检出限， 10 倍信噪比为定量限， 结果见表3， 可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.2.2 精密度试验 取供试品溶液（编号S1），在“2.1.4” 项色谱条件下进样测定6 次， 测得维生素B1、 次黄嘌呤、 甘草苷、 二苯乙烯苷、 淫羊藿苷、 甘草酸、 6-姜辣素、 大黄素保留时间RSD分别为0.32%、 0.14%、 0.29%、 0.31%、 0.20%、0.09%、 0.09%、 0.06%， 峰 面 积 RSD 分 别 为1.05%、 1.90%、 3.50%、 2.31%、 1.29%、 4.71%、1.84%、 3.92%， 表明仪器精密度良好。

2.2.3 重复性试验 取样品（编号S1） 6 份， 按“2.1.1” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1.4” 项色谱条件下进样测定， 测得维生素B1、 次黄嘌呤、 甘草苷、 二苯乙烯苷、 淫羊藿苷、 甘草酸、 6-姜辣素、大黄素保留时间RSD 分别为0.33%、 0.24%、 0.45%、0.46%、 0.27%、 0.14%、 0.12%、 0.12%， 峰面积RSD分 别 为 1.89%、 2.56%、 3.38%、 2.87%、 3.90%、4.52%、 2.08%、 2.72%， 表明该方法重复性良好。

2.2.4 稳定性试验 取供试品溶液（编号S1），在“2.1.4” 项色谱条件下于0、 4、 8、 16、 24 h进样测定， 测得维生素B1、 次黄嘌呤、 甘草苷、二苯乙烯苷、 淫羊藿苷、 甘草酸、 6-姜辣素、 大黄素保留时间RSD 分别为0.32%、 0.81%、 0.31%、0.38%、 0.14%、 0.09%、 0.12%， 0.65%， 峰 面积RSD 分别为3.21%、 2.72%、 3.54%、 2.10%、3.76%、 4.52%、 4.06%、 2.72%， 表 明 溶 液 在24 h内稳定性良好。

表2 各成分ESI-TOF／MS 鉴别结果Tab.2 Results of ESI-TOF／MS identification of various constituents

表3 各成分线性关系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.2.5 加样回收率试验 精密量取含有量已知的样品（编号S1） 1 mL， 共6 份， 精密加入各对照品适量， 按“2.1.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.4” 项色谱条件下进样测定， 测得维生素B1、 次黄嘌呤、 甘草苷、 二苯乙烯苷、 淫羊藿苷、甘草酸、 6-姜辣素、 大黄素平均加样回收率分别为96.50%、 94.29%、 95.94%、 97.48%、 91.10%、 95.27%、91.47%、 107.50%， RSD 分 别 为 2.78%、 6.36%、6.64%、 2.43%、 3.91%、 5.01%、 4.60%、 4.91%。

2.2.6 样品含有量测定 按“2.1.1” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1.4” 项色谱条件下进样测定， 计算含有量， 结果见表4。

表4 各成分含有量测定结果（μg／mL）Tab.4 Results of content determination of various constituents （μg／mL）

3 讨论

3.1 指标成分选择 安神补脑液为《金匮要略》收载的养心安神名方甘麦大枣汤的加减方[6］， 方中制何首乌补肝肾， 益精血， 起养心安神之效[15］；鹿茸富含磷脂、 氨基酸等营养物质， 在消除疲劳、增强免疫力的同时可改善睡眠质量[16］； 淫羊藿具有补肾壮阳、 强筋健骨功效[16］； 干姜温中散寒，具有养心、 延长睡眠时间的作用[17］； 甘草调和诸药。 2015 年版《中国药典》 中制何首乌、 淫羊藿、干姜、 甘草含有量测定指标分别为二苯乙烯苷和蒽醌（大黄素）、 淫羊藿苷、 6-姜辣素、 甘草苷和甘草酸， 而且维生素B1 具有维持神经正常的功能，《中国药典》 也将其列入[3］， 同时次黄嘌呤也是鹿茸抑制单胺氧化酶的有效成分[18］。 最终， 选择以上8 种成分作为安神补脑液含有量测定的指标成分。

3.2 色谱柱选择 本实验比较了Agilent XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、 Waters XELECTTM HSS T3 （3.0 mm×150 mm， 3.5 μm） 色谱柱， 发现后者对安神补脑液中各成分的分离效果较好。

3.3 流动相选择 本实验比较了甲醇-水、 乙腈-水流动相， 发现后者分离效果较好， 而且峰数多，基线平稳， 同时由于安神补脑液所含成分比较复杂， 等度洗脱难以进行有效分离， 故采用梯度洗脱。 然后， 本实验又向流动相中加入不同体积分数（0.2%、 0.3%、 0.4%、 0.6%） 甲酸， 发现0.4%甲酸能较好地改善拖尾现象， 并且峰形尖锐。

3.4 柱温、 体积流量选择 本实验调节柱温20、25、 35 ℃， 发现25 ℃下各成分色谱峰分离度和峰形较好。 安神补脑液中维生素B1 极性很大， 出峰时间过快， 受其他极性成分的影响较明显， 文献[9］ 报道， 流动相中加入盐可延缓该成分出峰时间， 而本实验采用初始低体积流量的方法也实现了较好分离， 并且操作简便易行。

3.5 检测波长选择 本实验通过紫外检测器对样品进行全波长（190～400 nm） 扫描， 发现278 nm处各成分色谱峰峰形良好， 基线稳定。

4 结论

本实验建立HPLC-DAD-ESI-TOF／MS 法分析安神补脑液中化学成分， 结果发现40 种， 并鉴定出其中20 种， 然后测定维生素B1、 次黄嘌呤、 甘草苷、 二苯乙烯苷、 淫羊藿苷、 甘草酸、 6-姜辣素、大黄素含有量， 可为该制剂药效物质基础及质量评价研究提供方法学支持。