GC 法同时测定小儿豉翘清热颗粒中9 种挥发性成分

李 超， 田 刚， 吴 菲， 朱法根， 刘 雪， 石心红， 封 亮，∗， 贾晓斌

（1. 济川药业集团有限公司， 江苏 泰兴 225400； 2. 中国药科大学中药学院， 江苏 南京 211198）

小儿豉翘清热颗粒由淡豆豉、 连翘、 薄荷、 荆芥、 栀子 （炒）、 大黄、 青蒿、 赤芍、 槟榔、 厚朴、 黄芩、 半夏、 柴胡、 甘草14 味药材组成， 具有疏风解表、 清热导滞的功效， 用于小儿风热感冒夹滞证[1-2］， 临床上可治疗小儿手足口病、 疱疹性咽炎、 急性扁桃体炎、 发热、 急性上呼吸道感染[3-4］， 方中荆芥、 薄荷、 连翘、 柴胡是提取其挥发油后通过包合物加到产品中， 区别于其他8 味药材。 目前， 关于小儿豉翘清热颗粒中有效成分质量控制的研究主要集中在HPLC／UPLC 法对1 种或多种成分含有量进行测定， 尚无挥发性成分的报道[5-7］。 为了更好地控制小儿豉翘清热颗粒质量，保证该制剂疗效稳定， 本实验建立GC 法[8-9］同时测定其中9 种挥发性成分的含有量， 为相关研究提供参考依据。

1 材料

小儿豉翘清热颗粒 （无糖）， 2 g／袋， 批号1801054， 购于济川药业集团有限公司。 Agilent 7890B 气相色谱仪（美国安捷伦科技公司）， 配置FID 检测器； XS205DU 电子分析天平（十万分之一， 瑞士梅特勒-托利多公司）； DF-101T 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市予华仪器有限公司）。α-蒎烯（批号D8-11-4， 含有量98.8%）、 β-蒎烯（批号CCHM700571-1601， 含有量97.5%）、 月桂烯（批号D8-11-3， 含有量90.7%）、 薄荷酮（批号D6-11-3， 含 有 量 99.8%）、 柠 檬 醛 （批 号CCHM700474-1512， 含有量98.2%） 对照品均购于美国Cato 公司； 柠檬烯（批号100470-201503，含有量96.0%）、 芳樟醇（批号1503-200001， 含有量100%）、 薄荷脑（批号110728-200508， 含有量100%）、 胡薄荷酮（批号111706-201606， 含有量99.8%） 对照品均购于中国食品药品检定研究院。 乙酸乙酯为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 DB-1 色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）， 程序升温（起始温度70 ℃， 2 ℃／min升至80 ℃， 维持15 min， 2 ℃／min 升至110 ℃，维持5 min， 60 ℃／min 升至290 ℃， 维持20 min）；进样口温度230 ℃； 检测器温度280 ℃； 分流比30 ∶1； 柱体积流量0.5 mL／min； 进样量1 μL； 溶剂乙酸乙酯； 载气氮气。 理论塔板数按柠檬烯峰计， 不低于4 000。

2.2 供试品溶液制备 精密称取颗粒约20 g， 置于500 mL 圆底烧瓶中， 加200 mL 水， 挥发油提取器部分加水至溢后， 加入1 mL 乙酸乙酯， 按照2015 年版《中国药典》 四部通则2204 甲法提取挥发油， 分取乙酸乙酯层， 定容至2 mL， 摇匀， 与乙酸乙酯按1 ∶1 比例稀释， 即得。

2.3 对照品溶液制备 精密称取对照品α-蒎烯10.37 mg、 β-蒎烯39.20 mg、 柠檬烯195.25 mg、芳 樟 醇10.49 mg、 薄 荷 酮15.55 mg、 薄 荷 脑66.94 mg、 胡薄荷酮11.26 mg， 置于2 mL 量瓶中； 精密称取月桂烯10.41 mg， 置于5 mL 量瓶中； 精密称取柠檬醛10.50 mg， 置于10 mL 量瓶中， 乙酸乙酯稀释至刻度， 即得。

2.4 阴性样品溶液制备 按照工艺制备缺柴胡、连翘、 荆芥、 薄荷的阴性样品， 按“2.2” 项下方法制备， 即得。

2.5 专属性试验 精密吸取对照品、 供试品、 阴性样品溶液各1 μL， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 结果见图1。 由图可知， 供试品溶液中各成分色谱峰分离度理想， 阴性无干扰， 方法专属性良好。

2.6 线性关系考察 精密称取对照品α-蒎烯11.42 mg、 β-蒎烯40.58 mg、 芳樟醇10.75 mg、薄荷酮30.38 mg、 胡薄荷酮10.55 mg 于同一2 mL量瓶中， 乙酸乙酯稀释至刻度， 作为溶液①； 精密吸取“2.3” 项下月桂烯、 柠檬烯、 薄荷脑、 柠檬醛对照品溶液及溶液①各1 mL， 置于同一5 mL 量瓶中， 乙酸乙酯定容， 精密吸取适量， 乙酸乙酯稀释成系列质量浓度， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定。 以溶液质量浓度为横坐标（X）， 峰面积为纵坐标（Y） 进行回归， 结果见表1， 可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.7 稳定性试验 精密吸取“2.3” 项下对照品溶液0.125 mL 于5 mL 量瓶中， 乙酸乙酯稀释至刻度， 吸取它和供试品溶液各1 μL， 于0、 4、 6、 8、10、 12、 18、 24 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 测得α-蒎烯、 β-蒎烯、 月桂烯、 柠檬烯、 芳樟醇、 薄荷酮、 薄荷脑、 胡薄荷酮、 柠檬醛对照品溶液峰面积RSD 分别为1.1%、 1.3%、 1.1%、1.5%、 1.9%、 1.8%、 1.9%、 1.9%、 6.7%， 供 试品溶液分别为0.37%、 0.38%、 0.89%、 0.71%、1.6%、 1.3%、 1.2%、 1.6%、 2.9%， 表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.8 精密度试验 取同一对照品溶液， 在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次， 每次1 μL， 测得α-蒎烯、 β-蒎烯、 月桂烯、 柠檬烯、 芳樟醇、 薄荷酮、 薄荷脑、 胡薄荷酮、 柠檬醛峰面积RSD 分别为1.2%、 1.3%、 1.0%、 1.3%、 1.3%、 1.3%、1.4%、 1.1%、 7.9%， 表明仪器精密度良好。

图1 各成分GC 色谱图Fig.1 GC chromatograms of various constituents

2.9 重复性试验 取同一批颗粒， 按“2.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 测得α-蒎烯、 β-蒎烯、 月桂烯、 柠檬烯、 芳樟醇、 薄荷酮、 薄荷脑、 胡薄荷酮、 柠檬醛含有量RSD 分别为2.6%、 2.7%、3.2%、 2.6%、 2.9%、 2.8%、 2.7%、 2.9%、5.3%， 表明该方法重复性良好。

2.10 加样回收率试验 精密称取含有量已知的颗粒6 份， 每份10 g， 置于500 mL 圆底烧瓶中， 精密加入适量对照品溶液， 按“2.2” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。 结果， α-蒎烯、 β-蒎烯、 月桂烯、 柠檬烯、 芳樟醇、 薄荷酮、 薄荷脑、 胡薄荷酮、 柠檬醛平均加样回收率分别为101.2%、 101.5%、100.6%、 97.36%、 96.39%、 102.2%、 98.02%、99.95%、 98.32%， RSD 分 别 为 1.4%、 2.1%、2.8%、 2.6%、 1.3%、 1.7%、 2.8%、 2.4%、 2.6%。

2.11 样品含有量测定 取9 批颗粒， 按“2.2”项下方法制备供试品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 计算含有量， 结果见表2。

表2 各成分含有量测定结果Tab.2 Results of content determination of various constituents

3 讨论

3.1 色谱条件选择 本实验比较DB-1 （30 m×0.25 mm， 0.25 μm）、 CAM （30 m× 0.53 mm，1.0 μm）、 DB-5 ms （30 m×0.25 mm， 0.5 μm）、DB-WAX （30 m×0.25 mm， 0.25 μm） 毛细管色谱柱， 发现采用DB-1 色谱柱分析时各成分分离度理想。 通过程序升温考察初始温度、 柱体积流量、 升温速率、 分流比对色谱峰分离度的影响， 最终确定初始温度为70 ℃， 柱体积流量为0.5 mL／min， 分流比为30 ∶1。 采用2015 年版《中国药典》 四部通则2204 甲法提取挥发油， 发现温度对提取有很大影响， 最终确定其为140 ℃。 研究石油醚、 乙酸乙酯对色谱峰的影响， 最终确定后者作为提取溶剂。 考察恒温、 程序升温对各成分分离度的影响，发现恒温时分离度不理想， 最终确定在“2.1” 项条件下进行程序升温。

3.2 含有量分析 表3 显示， 9 批小儿豉翘清热颗粒中各成分含有量有明显差异， 以柠檬醛、 柠檬烯更显著， 可能是由于不同批次样品所用药材中挥发油差异较大所致[10-11］。 因此， 有必要建立该成分含有量标准， 控制成品质量稳定均一， 从而确保疗效。