HPLC 法同时测定麝香保心丸中间体中7 种成分

朱诗竟， 李淞明， 詹常森

（上海和黄药业有限公司， 上海中药固体制剂创新工程技术研究中心， 上海 201401）

麝香保心丸由人工麝香、 人参、 人工牛黄、 肉桂、 苏合香、 蟾酥、 冰片7 味药材组成， 是在苏合香丸的基础上研制而成， 功效芳香温通、 益气强心， 用于心肌缺血引起的心绞痛、 胸闷、 心肌梗塞， 对各类型心绞痛均具有良好的治疗效果[1］。方中肉桂性辛、 甘、 热， 归肾、 脾、 心、 肝经， 具有补火助阳、 散寒止痛、 温通经脉等作用， 主要含有挥发油、 二萜及其糖苷、 黄烷醇及其多聚体， 以及黄酮、 多酚等成分， 其中桂皮醛、 肉桂酸含有量测定的报道较多[2-7］， 2015 年版《中国药典》[7］以前者为检测指标； 蟾酥味甘、 辛， 性温， 有毒， 具有解毒、 消肿、 醒神、 开窍、 强心、 止痛等作用，主要含有蟾蜍毒素、 蟾毒配基、 蟾毒色胺等成分[8-13］， 2015 年版《中国药典》[14］以华蟾酥毒基、酯蟾毒配基为检测指标。

日蟾毒他灵、 蟾毒灵、 华蟾酥毒基、 肉桂酸为麝香保心丸入血成分； 蟾毒他灵、 酯蟾毒配基均为蟾酥活性成分群——蟾蜍甾二烯类， 而且后者是药典规定的蟾酥含有量测定指标成分； 香豆素为肉桂中活性成分。 因此， 本实验建立HPLC 法同时测定麝香保心丸中间体中上述7 种成分的含有量， 以期为该制剂全面质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260 Infinity 型高效液相色谱仪， 配置四元梯度泵、 二极管阵列检测器、 控温柱温箱、 自动进样器、 ChemStation 工作站（美国Agilent 公司）； XS205DU 电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）； SB-5200DTD 超声波仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 试药 肉桂酸（批号110786-200503）、 蟾毒灵（批号111981-201503）、 华蟾酥毒基 （批号110803-201406）、酯蟾毒配基（ 批 号 110718-201108） 对照品均购自中国食品药品检定研究院；日蟾毒他灵 （批号150809）、 蟾毒他灵 （批号150926） 对照品均购自成都普菲德生物技术有限公司； 香豆素（批号C4261-50G） 对照品购自西格玛奥德里奇（上海） 贸易有限公司。 麝香保心丸中间体（上海和黄药业有限公司， 批号20160605、20160606、 20160609）。乙腈为色谱纯（美国Fisher公司）； 其他试剂均为分析纯； 水为超纯水（美国Millipore 超纯水仪制备）。

2方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）； 流动相乙腈-0.1% 磷酸， 梯度洗脱， 程序见表1； 柱温30 ℃； 检测波长280 nm； 进样量10 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution programs

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取各对照品适量， 置于同一10 mL 量瓶中， 甲醇定容至刻度， 即得（日蟾毒他灵0.17 mg／mL、 香豆素0.081 1 mg／mL、 肉桂酸0.057 1 mg／mL、 蟾毒他灵0.365 5 mg／mL、 蟾毒灵0.351 5 mg／mL、 华蟾酥毒基0.441 5 mg／mL、酯蟾毒配基0.415 5 mg／mL）。

2.2.2 供试品溶液 取中间体适量， 研磨后精密称取2 g， 置于具塞三角烧瓶中， 加入20 mL 甲醇，密塞， 称定质量， 超声30 min， 放冷， 甲醇补足减失的质量， 上清液过0.22 μm 微孔滤膜， 取续滤液， 即得。

2.2.3 阴性样品溶液 按照处方和制备工艺去掉肉桂、 蟾酥、 苏合香， 将人工麝香、 人参提取物、人工牛黄、 冰片细粉混匀， 作为阴性样品， 按“2.2.2” 项下方法制备， 即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适用性考察与专属性试验 取对照品、供试品、 阴性样品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 结果见图1。 由图可知， 各成分色谱峰分离度均＞1.5， 阴性无干扰， 方法专属性良好。

2.3.2 线性关系考察 将对照品溶液逐级稀释成系列质量浓度， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定。 以峰面积为纵坐标（Y）， 质量浓度为横坐标（X） 进行回归， 结果见表2， 可知各成分在各自范围内呈良好的线性关系。

2.3.3 精密度试验 取“2.2.1” 项下对照品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定6 次， 测得日蟾毒他灵、 香豆素、 肉桂酸、 蟾毒他灵、 蟾毒灵、 华蟾酥毒基、 酯蟾毒配基峰面积RSD 分别为0.12%、 0.17%、 0.24%、 0.21%、 0.19%、 0.18%、2.04%， 表明仪器精密度良好。

图1 各成分HPLC 色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.4 稳定性试验 取同一批中间体， 按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液， 于0、 2、 4、6、 8、 12 h 在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 测得日蟾毒他灵、 香豆素、 肉桂酸、 蟾毒他灵、 蟾毒灵、 华蟾酥毒基、 酯蟾毒配基峰面积RSD 分别为2.68%、 0.57%、 2.35%、 0.76%、 0.76%、 0.80%、2.75%， 表明溶液在12 h 内稳定性良好。

2.3.5 重复性试验 取同一批中间体， 按“2.2.2” 项下方法平行制备6 份供试品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 测得日蟾毒他灵、香豆素、 肉桂酸、 蟾毒他灵、 蟾毒灵、 华蟾酥毒基、 酯蟾毒配基含有量RSD 分别为1.35%、1.11%、 2.30%、 1.19%、 1.39%、 1.13%、 0.73%，表明该方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 精密称取各对照品适量，加到含有量已知的同一批中间体中， 平行6 份， 按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 计算回收率。 结果， 日蟾毒他灵、 香豆素、 肉桂酸、 蟾毒他灵、 蟾毒灵、 华蟾酥毒基、 酯蟾毒配基平均加样回收率分别为98.73%（RSD=1.56%）、 99.16% （RSD=0.93%）、 98.24%（RSD=1.64%）、 102.49% （RSD=1.27%）、 100.05%（RSD=1.86%）、 100.64% （RSD=2.12%）、 100.26%（RSD=2.87%）。

2.4 样品含有量测定 取3 批中间体， 按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液， 在“2.1” 项色谱条件下进样测定， 计算含有量， 结果见表3。

表3 各成分含有量测定结果（mg／g， n=3）Tab.3 Results of content determination of various constituents （mg／g， n=3）

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法选择 本实验考察了提取溶剂和提取方式， 综合考虑试剂毒性、 提取效率、 色谱峰分离度及响应值， 最终确定供试品溶液制备方法为甲醇超声提取30 min。

3.2 阴性样品制备方法选择 7 种成分均为肉桂或蟾酥中所含， 同时苏合香中含有桂皮醛， 并且易被氧化成肉桂酸， 故在阴性样品中不含肉桂、 蟾酥、 苏合香。

4 结论

本实验建立HPLC 法同时测定麝香保心丸中间体中日蟾毒他灵、 香豆素、 肉桂酸、 蟾毒他灵、 蟾毒灵、 华蟾酥毒基、 酯蟾毒配基的含有量， 该方法简便准确， 重复性好， 可为该制剂全面质量控制提供依据。