淫羊藿苷对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞上皮间质转分化的作用及机制*

王申伟 ，王琼 ，陈军童 ，赵艳艳

（1.河南科技大学附属许昌市中心医院肾内科，许昌 461000；2.郑州大学第一附属医院内分泌科，郑州 450000）

肾间质纤维化是各种慢性肾脏病进展到终末期肾病的主要病理特征，其轻重程度是各种肾脏疾病向肾功能的恶化程度的关键因素，成为了威胁世界公共健康的主要疾病之一[1-2]。肾小管上皮细胞向上皮-间质转化是肾间质纤维化的发病关键环节，主要是上皮细胞的黏附能力降低，α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的表达增加，基底膜破坏以及细胞侵袭和迁移能力增加[3-4]。上皮质间质转化受许多细胞因子的调控，如转化生长因子-β1（TGF-β1），是一种致纤维化因子，研究表明其对肾小管上皮细胞上皮间质转化至关重要[5]。因此，阻断或抑制TGF-β1的作用已成为防治肾间质纤维化的重要靶点。

淫羊藿苷是淫羊藿中重要有效成分，具有补肝肾、强筋骨和祛风湿等作用[6]。研究表明，淫羊藿苷对肝、肾等脏器具有保护作用，对防治肾纤维化具有较好的疗效[7]。但淫羊藿苷对肾小管上皮细胞的上皮间质转化的作用尚不明确。基于此，本研究采用人肾皮质近曲小管上皮细胞（HK-2），通过TGF-β1诱导后，分别采用不同浓度的淫羊藿苷干预后，观察细胞的增殖，迁移和侵袭能力，以及上皮间质转化的相关因子α-SMA、上皮细胞钙黏蛋白（ECad）、波形蛋白（Vim）以及Samd信号通路的变化。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂及试剂盒 HK-2细胞购自中科院上海细胞库。FBS胎牛血清、DMEM/F12培养基和 0.05%的胰蛋白酶（Gibco，Waltham，MA）；淫羊藿苷（Sigma-Aldrich）；TGF-β1（广州聚研生物有限公司）；Trizol试剂和 BCA 试剂（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，lnc.）；CCK-8 试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；0.25%甲紫溶液（索莱宝科技有限公司）；Transwell小室（密理博科技有限公司）；PrimeScriptTM RT 试剂盒（Takara Biotechnology）；SYBR-Green qPCR Master Mix（北京康润诚业生物科技有限公司）；RIPA缓冲液、一抗稀释液、二抗稀释液、SDS-PAGE和PVDF膜（上海碧云天生物技术有限公司）；鼠抗人 α-SMA、E-cadherin、vimentin、Smad2/3、p-Smad2/3和 GAPDH单分子抗体（Abcam）；兔抗鼠二抗（Cell Signaling Technology）；超敏发光液ECL（北京四正柏生物科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 HK-2细胞通过常规复苏后，用含10%FBS的DMEM/F12培养液，于37℃恒温，5% CO2的培养箱中进行培养。隔日进行传代1次，实验使用的细胞为对数生长期的细胞。

1.2.2 细胞转染和分组 将HK-2细胞接种于6孔板，待其长至密度40%～50%后，将其分为空白对照组、TGF-β1 组、TGF-β1+淫羊藿苷（10、20、40μmol/L）组。TGF-β1组是将10 μg/L的TGF-β1干预HK-2细胞 24 h。TGF-β1+淫羊藿苷（10、20、40 μmol/L）组是 HK-2细胞在 10 μg/L TGF-β1诱导 24 h后，换成 10、20、40 μmol/L 的淫羊藿苷干预 24 h。空白对照组是未干预的HK-2细胞。

1.2.3 细胞增殖 将空白对照组、TGF-β1组、TGF-β1+淫羊藿苷（10、20、40 μmol/L）组在铺于96孔板内，每孔细胞数量为5 000个/孔。每1组均需要设立6个复孔用于计算该组平均值。在各组药物干预过后，添加CCK-8试剂，每孔10 μL/孔。在37℃孵育2 h，放入酶标仪内，450 nm检测各孔OD值，分析各组细胞增殖情况。实验均独立重复3次。

1.2.4 细胞划痕实验 待空白对照组、TGF-β1组、TGF-β1+淫羊藿苷（10、20、40 μmol/L） 组的 HK-2细胞长至80%～90%，用10 μL枪头尖端在培养皿中央垂直划一道痕迹，用PBS洗去脱壁的细胞，于培养箱培养0、24 h后，放于倒置显微镜观察划痕两侧细胞迁移的距离，迁移率=（划痕宽度0 h-划痕宽度12 h/24 h）/划痕宽度0 h×100%。该实验需独立重复3次。

1.2.5 Transwell小室检测细胞侵袭能力 实验分为空白对照组、TGF-β1组、TGF-β1+淫羊藿苷（10、20、40 μmol/L）组。TranswellTM 小室上层表面加入100 μL 的基质胶（Matrigel），摇匀后放置培养箱40 min。将100 μL不含血清培养基稀释淫羊藿苷分别至 10、20、40 μmol/L 以及添加 10 μg/L TGF-β1，调整HK-2细胞密度至每毫升3×105个，取500 μL接种至上层。每组设立3个复孔。培养箱培养12 h后，将小室取出，用甲醇固定15 min后，风干后，再向孔内添加2.5 mL/L甲紫溶液染色30 min。将小室放在倒置显微镜下随机选取5个视野（×200），拍照记录迁移下室的细胞总数。该实验需独立重复3次。

1.2.6 实时荧光定量PCR法检测相关基因mRNA表达水平 将空白对照组、TGF-β1组、TGF-β1+淫羊藿苷（10、20、40 μmol/L）组的细胞收集后，通过Trizol试剂分别提取各组总RNA。通过NanoDrop 2000分光光度计检测RNA纯度和浓度，使用总RNA逆转录扩增为cDNA（反转录条件：37℃ 60 min，85 ℃ 5 min）。20 μL PCR 反应体系：0.4 μL 目的模板cDNA，10 μL SYBR-Green qPCR Master Mix 和对应的上下游引物各 0.4 μL，8.8 μL ddH2O。PCR 扩增条件为：95℃预变性2 min，95℃变性15 s，60℃退火 45 s，72℃ 延伸 30 s，共计 40个循环，在 ABI 7500 fast仪器中进行。以GAPDH作为mRNA的标准内参，基因表达结果均以2-ΔΔCt进行统计。本实验所有PCR引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR所需的引物序列

1.2.7 蛋白质印迹法检测相关蛋白表达水平 将空白对照组、TGF-β1 组、TGF-β1+淫羊藿苷（10、20、40 μmol/L）组细胞液氮碾磨后，用 RIPA 缓冲液和PMSF抑制蛋白降解液（100∶1）将样本裂解后提取各组总蛋白。通过BCA试剂检测蛋白质的总浓度，将各组的总蛋白浓度调为一致，将其于100℃进行变性后保存至-20℃。SDS-PAGE电泳分离总蛋白后，将其转膜至PVDF膜。然后用5%脱脂牛奶封闭2 h，TBST洗涤3次，每次10 min后，将其放入对应的一抗（α-SMA、E-cadherin、vimentin、Smad2/3、p-Smad2/3 和 GAPDH）和一抗稀释混悬液（1∶1 000）中，4℃孵育过夜。再用TBST洗涤3次，放入二抗和二抗稀释液（1∶4 000）混悬液中，室温孵育 2 h。TBST洗涤3次，每次10 min，将超敏发光液ECL滴在膜上，放入化学发光成像仪（Invitorgen，USA）进行蛋白显影。通过Image J软件进行分析结果，相对蛋白表达以GAPDH标准化。

1.3 统计学方法 应用SPSS 20.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，各组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 淫羊藿苷抑制TGF-β1诱导的HK-2增殖能力 CKK-8的结果表明，与空白对照组比较，TGF-β1组的细胞增殖水平显著增加（P＜0.05）。与TGF-β1组比较，随着淫羊藿苷干预浓度的增加，细胞增殖水平的差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 不同浓度淫羊藿苷对TGF-β1诱导的HK-2细胞增殖影响（±s）

表2 不同浓度淫羊藿苷对TGF-β1诱导的HK-2细胞增殖影响（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与 TGF-β1 组比较，#P＜0.05。

组别 数量 增殖水平，OD值空白对照组 3 1.042±0.065 TGF-β1 组 3 1.863±0.094*淫羊藿苷组（10 μmol/L） 3 1.316±0.081#淫羊藿苷组（20 μmol/L） 3 1.259±0.082#淫羊藿苷组（40 μmol/L） 3 1.221±0.062#

2.2 淫羊藿苷抑制TGF-β1诱导的HK-2侵袭能力 Transwell侵袭实验结果表明，TGF-β1组侵袭细胞数显著高于空白对照组（P＜0.05）。TGF-β1+淫羊藿苷（10、20、40 μmol/L）组侵袭细胞数显著低于TGF-β1组（P＜0.05），随着淫羊藿苷干预浓度增加，细胞侵袭数量的差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1A和表3。

图1 5组HK-2细胞的侵袭情况（×200）

表3 不同浓度淫羊藿苷对TGF-β1诱导的HK-2细胞侵袭能力影响（±s）

表3 不同浓度淫羊藿苷对TGF-β1诱导的HK-2细胞侵袭能力影响（±s）

注：5组HK-2细胞侵袭数量的柱状图分析（与空白对照组比较，*P＜0.05；与 TGF-β1 组比较，#P＜0.05）。

组别 数量 侵袭数量，个空白对照组 3 71.2±5.12 TGF-β1组 3 201.1±9.24*淫羊藿苷组（10 μmol/L） 3 141.8±7.81#淫羊藿苷组（20 μmol/L） 3 112.3±6.28#淫羊藿苷组（40 μmol/L） 3 99.4±4.17#

2.3 淫羊藿苷抑制TGF-β1诱导的HK-2迁移能力 划痕实验结果显示，与空白对照组比较，TGF-β1组在24 h内迁移率显著增加（P＜0.05）。与TGF-β1 组比较，TGF-β1+淫羊藿苷（10、20、40 μmol/L）组在24 h内迁移率显著下降（P＜0.05）。随着淫羊藿苷增加，迁移率差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2A和表4。

图2 24 h 5组HK-2细胞的迁移情况（×40）

表4 不同浓度淫羊藿苷对TGF-β1诱导的HK-2细胞侵袭能力影响（±s）%

注：5组24 h HK-2细胞划痕率的柱状图分析（与空白对照组比较，*P＜0.05；与 TGF-β1 组比较，#P＜0.05）。

组别 数量 迁移率空白对照组 3 42.5±3.27 TGF-β1组 3 68.1±2.41*淫羊藿苷组（10 μmol/L） 3 48.3±1.19#淫羊藿苷组（20 μmol/L） 3 44.3±1.83#淫羊藿苷组（40 μmol/L） 3 43.7±2.71#

2.4 淫羊藿苷抑制TGF-β1诱导的HK-2上皮间质转化能力 实时定量PCR和Western blot结果显示，与空白对照组比较，TGF-β1组的 α-SMA、vimentin蛋白和mRNA的表达量显著增加（P＜0.05），而E-cadherin蛋白和mRNA表达量显著降低（P＜0.05）。与 TGF-β1组比较，TGF-β1+淫羊藿苷（10、20、40 μmol/L） 组的 α-SMA、vimentin 蛋白和mRNA的表达量显著降低（P＜0.05），E-cadherin蛋白和 mRNA 表达量显著增加（P＜0.05），TGF-β1+淫羊藿苷（10、20、40 μmol/L）组组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 3A 和表 5、6。

表5 不同浓度淫羊藿苷对TGF-β1诱导的HK-2细胞中α-SMA、vimentin、E-cadherin 蛋白表达情况的影响（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与 TGF-β1 组比较，#P＜0.05。

组别 数量 α-SMA vimentin E-cadherin空白对照组 3 0.171±0.041 0.221±0.036 1.150±0.095 TGF-β1 组 3 0.761±0.078*1.052±0.096*0.123±0.018*淫羊藿苷组（10 μmol/L） 3 0.421±0.056#0.398±0.059#0.942±0.048#淫羊藿苷组（20 μmol/L） 3 0.362±0.049#0.371±0.079#0.891±0.078#淫羊藿苷组（40 μmol/L） 3 0.331±0.059#0.302±0.094#0.921±0.099#

表6 不同浓度淫羊藿苷对TGF-β1诱导的HK-2细胞中α-SMA、vimentin、E-cadherin 基因表达情况的影响（±s）

表6 不同浓度淫羊藿苷对TGF-β1诱导的HK-2细胞中α-SMA、vimentin、E-cadherin 基因表达情况的影响（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与 TGF-β1 组比较，#P＜0.05。

组别 数量 α-SMA vimentin E-cadherin空白对照组 3 0.326±0.097 0.301±0.036 1.000±0.080 TGF-β1 组 3 0.612±0.096*0.735±0.038*0.452±0.018*淫羊藿苷组（10 μmol/L） 3 0.333±0.056#0.401±0.059#0.812±0.058#淫羊藿苷组（20 μmol/L） 3 0.362±0.037#0.399±0.079#0.851±0.078#淫羊藿苷组（40 μmol/L） 3 0.328±0.031#0.362±0.044#0.892±0.048#

2.5 淫羊藿苷阻碍TGF-β1诱导的HK-2中Smad信号通路 Western blot结果显示，与空白对照组比较，TGF-β1组的p-Smad2/3/Smad2/3蛋白比值显著增加（P＜0.05）。与 TGF-β1组比较，TGF-β1+淫羊藿苷（10、20、40 μmol/L）组的 p-Smad2/3/Smad2/3蛋白显著降低（P＜0.05）。与 TGF-β1+淫羊藿苷（20 μmol/L）组比较，TGF-β1+淫羊藿苷（40 μmol/L）组和 TGF-β1+淫羊藿苷（10 μmol/L）组的 p-Smad2/3/Smad2/3蛋白比值差异无统计学意义（P＞0.05）。见图4和表7。

图4 不同浓度的淫羊藿苷对Smad信号通路Smad2/3和p-Smad2/3蛋白表达情况

表7 不同浓度的淫羊藿苷对p-Smad2/3/Smad2/3蛋白比值比较（±s）

表7 不同浓度的淫羊藿苷对p-Smad2/3/Smad2/3蛋白比值比较（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05；与 TGF-β1 组比较，#P＜0.05。

组别 数量 p-Smad2/3/Smad2/3空白对照组 3 0.421±0.079 TGF-β1 组 3 0.875±0.082*TGF-β1+淫羊藿苷（10 μmol/L）组 3 0.484±0.023#TGF-β1+淫羊藿苷（20 μmol/L）组 3 0.503±0.048#TGF-β1+淫羊藿苷（40 μmol/L）组 3 0.442±0.052#

3 讨论

近年来，尽管慢病肾脏病的治疗效果取得进展，但仍合适的药物和方法对慢病肾脏病患者进行有效的根治，由于肾间质内的纤维化加剧，最终发展为终末期肾病[8]。肾小管上皮细胞的上皮间质转化是活化的肌成纤维细胞的重要来源，其主要表现为上皮细胞的黏附性降低，α-SMA的表达能力减低以及细胞的迁移和侵袭能力增加[4，10]。上皮间质转化的发生过程需要多种分子参与，如TGF-β1，其作为最强的促纤维化因子，在肾脏纤维化中表达量增加，可通过Smad信号通路介导上皮间质转化过程[11-12]。在TGF-β1的诱导下，肾小管上皮细胞表型发生变化，上皮间质转化的标志性蛋白E-cadherin表达量减少，间充质标志性蛋白α-SMA的表达量增加，其机制主要是由于TGF-β1激活转录因子Smad2/3磷酸化，继而与Smad4共同活化形成低聚复合体，启动核转录信号，最终调控肾脏上皮间质转化相关因子的表达[5，13]。本研究结果显示，与空白对照组比较，TGF-β1诱导后，HK-2细胞的增殖，迁移和侵袭能力明显增加，并且α-SMA、vimentin蛋白和mRNA表达量增多，E-cadherin蛋白和基因表达量减少，表明TGF-β1刺激后HK-2细胞发生了EMT，提示构建成功肾小管上皮细胞上皮间质转化模型。进一步研究结果显示，TGF-β1诱导后，HK-2细胞中Smad信号通路被激活，p-Smad2/3与Smad2/3的比值明显增加，这说明，TGF-β1诱导HK-2细胞中可能是通过激活Smad信号通路而影响其上皮间质转化能力。

淫羊藿苷作为淫羊藿主要的有效成分之一，具有滋肾壮阳，保护肾脏等功能[14]。研究表明：淫羊藿苷对减轻慢性肾衰竭大鼠的肾脏组织纤维化，抑制肾小管萎缩[15]。淫羊藿苷可抑制由TGF-β1刺激的肾成纤维细胞的增殖和内源性TGF-β1的表达，对肾纤维化具有较好的效果[16]。本实验结果显示，10、20、40 μmol/L的淫羊藿苷均可以抑制 TGF-β1诱导的HK-2细胞的增殖，迁移和侵袭能力，并且随着淫羊藿苷浓度的增加，其对TGF-β1诱导的HK-2细胞的抑制能力无明显变化。本实验Western blot和qPCR结果显示，α-SMA、vimentin蛋白和基因表达量减少，E-cadherin蛋白和基因表达量增加，说明淫羊藿苷可抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞的上皮间质转化能力，但不会随着淫羊藿苷浓度增加而抑制能力增加。为了进一步探究淫羊藿苷对HK-2细胞的作用机制，本研究检测Smad信号通路的变化。实验结果显示，10、20、40 μmol/L 的淫羊藿苷均能抑制TGF-β1诱导HK-2细胞的Smad信号通路的传导，主要是p-Smad2/3与Smad2/3蛋白比值明显降低。

综上所述，TGF-β1可诱导肾小管上皮细胞的上皮间质转化，其可通过激活Smad2/3的磷酸化，从而引起上皮间质转化的相关因子表达发生变化。淫羊藿苷能显著逆转TGF-β1诱导肾小管上皮细胞的上皮间质转化以及增殖，侵袭和迁移能力，本研究也证实淫羊藿苷可通过抑制Smad2/3的磷酸化，从而调控上皮间质转化相关因子α-SMA、vimentin和E-cadherin的表达，从而影响肾小管上皮细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮间质转化能力。由于肾纤维化形成的机制十分复杂，与多种细胞因子和信号通路相关，因此，淫羊藿苷对治疗肾纤维化的效果和作用仍需进一步实验验证。