HPLC 法同时测定甘草酸二铵制剂中18 α 和18 β 甘草酸二铵含量*

张轶华，田晓彤，孙 婷，高燕霞，李 挥

（河北省药品医疗器械检验研究院，河北 石家庄 050200）

甘草酸二铵是从甘草中分离、筛选的主要活性成分甘草酸的二铵盐，具有非特异性抗炎、抗过敏、稳定溶酶体膜及免疫调节作用，其抗病毒作用尤为突出。甘草酸二铵有2 个18 位差向异构体，虽然二者的分子结构仅18 位手性碳原子构型不同，但其在理化性质、药效学、药动学、不良反应等方面均存在差异，且分离测定存在一定困难。现同时测定2 个差向异构体的方法有薄层色谱（TLC）法和气相色谱（GC）法，其中 TLC 法灵敏度太低，而GC 法需要复杂的衍生化。现行标准中未对差向异构体进行分析［1］，虽有高效液相色谱（HPLC）法测定甘草酸差向异构体的报道，但这些方法［2－5］耐用性较差。本研究中建立了同时测定甘草酸二铵制剂中18 α甘草酸二铵和18 β 甘草酸二铵含量的HPLC 法，为深入研究这2 个差向异构体的区别提供了定性、定量依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Ultimate 3000 型高效液相色谱仪，包括四元低压梯度泵、全自动进样器、柱温箱和紫外检测器（美国Dionex 公司）；XPR26 ／A 型电子天平（瑞士 Mettler Toledo 公司）。

1.2 试药

18 α 甘草酸二铵对照品（a 厂，批号为 120703，含量为 99.0% ）；18 β 甘草酸 二铵对照品 （a 厂，批 号为130106，含量为 99.5%）；甘草酸二铵胶囊（a 厂，批号分别为 100411，100412，100413）；注射用甘草酸二铵（b 厂、批号为 100131，c 厂、批号分别为 091103，100603，d 厂、批号为 110501，e 厂、批号分别为 1008213 －2，0909215 － 2，0810203 －1）；甘草酸二铵注射液（a 厂、批号分别为1003271，1004031，1004241，f 厂、批号为10060715，g 厂、批号分别为 0908021，1006131，h 厂、批号为 120111，i 厂、批号为 310060801，j 厂、批号分别为 08120601，10091801，10091802，k 厂 、批 号 为089131101，l 厂、批号为 090301）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为双蒸水。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18柱（200 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：水 －60% 高氯酸溶液（48 ∶0.5，V ／ V，用氨水调pH 至 8.0） － 甲醇（48 ∶52，V ／ V）；流速：1.0 mL ／min；检测波长：248 nm；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。

2.2 溶液制备

称取18 α 甘草酸二铵和18 β 甘草酸二铵对照品各25 mg，精密称定，置同一25 mL 容量瓶中，加甲醇－水（50 ∶50，V ／ V）溶解并定容，摇匀，即得混合对照品溶液。取胶囊剂型样品10 粒，另2 种剂型样品各5 瓶，内容物混匀，精密称取（量取）约相当于甘草酸二铵25 mg，置50 mL容量瓶中，用甲醇 － 水（50 ∶50，V ／ V）溶解并定容，摇匀，即得供试品溶液。取3 种剂型样品的辅料，以甲醇－水（50 ∶50，V ／ V）溶解制成阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

系统适用性试验：精密吸取2.2 项下混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各适量，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置有吸收峰，阴性对照无干扰。理论板数以18α 甘草酸二铵、18β 甘草酸二铵峰计均大于1 500。分离度均大于1.5，基线分离良好。详见图1。

线性关系与检测限考察：用流动相稀释混合对照品溶液，制成质量浓度分别为 1.0，0.5，0.3，0.1，0.05，0.01，0.005 mg ／mL 的系列混合对照品溶液，按 2.1 项下色谱条件各进样 20 μL，记录色谱图。分别以 18 α 甘草酸二铵和18 β 甘草酸二铵峰面积（Y）为纵坐标、进样质量浓度（X，mg／mL）为横坐标进行线性回归，得回归方程 Y1＝ 37.826 X1＋ 0.737（r ＝ 0.999 7，n ＝ 7），Y2＝49.436X2＋0.248（r ＝0.999 3，n ＝7）。结果表明，18α甘草酸二铵和18 β 甘草酸二铵的质量浓度均在0.005 ～1.0 mg／mL 范围内与峰面积线性关系良好。以信噪比（S ／ N）＝ 3 计算 18 α 甘草酸二铵和 18 β 甘草酸二铵的检测限，结果分别为 0.056 mg ／mL 和 0.082 mg ／mL。

图1 高效液相色谱图1.18 α － glycyrrhizic acid 2.18 β － glycyrrhizic acidA.Mixed reference solution B － D.Test solution（the batch numbers are 100411，100131，1003271）E.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

精密度试验：分别取混合对照品溶液，按2.1 项下色谱条件连续进样6 次，测定峰面积。结果18 α 甘草酸二铵和18 β 甘草酸二铵峰面积的 RSD 分别为0.42%和 0.60%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取不同剂型样品（批号分别为100411，0909215 －2，10091801），分别按 2.2 项下方法制备供试品溶液，分别于室温放置 0，4，8，12，24 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果3 批样品 中 的 RSD 分 别 为 0.56% 和 0.63% ，0.49% 和0.59%，0.62%和 0.69%（n ＝5），表明供试品溶液室温下放置24 h 内基本稳定。

重复性试验：取不同剂型（批号分别为100411，0909215 － 2，10091801）适量，分别按 2.2 项下方法制备供试品溶液，平行6 份，按2.1 项下色谱条件进样测定。结果 3 批样品中，18 α 甘草酸二铵和 18 β 甘草酸二铵含量平均值分别为 67.33% 和 33.72% ，66.32% 和32.98% ，67.25% 和 32.25% ，RSD 分别为 0.26% 和0.43% ，0.25% 和 0.48% ，0.61% 和 0.38% （n ＝ 6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：分别取已知18α 甘草酸二铵和18β甘草酸二铵含量的不同剂型样品（批号分别为100411，100131，1003271）各 9 份，分别加入低、中、高质量浓度的混合对照品溶液，按2.2 项下方法制备供试品溶液，并按2.1 项下色谱条件进样测定，计算2 种甘草酸异构体含量，并计算加样回收率。结果见表1 至表3。

表1 甘草酸二铵胶囊加样回收试验结果（n ＝9）Tab.1 Results of the recovery test of Diammonium Glycyrrhizinate Capsules（n ＝ 9）

表2 注射用甘草酸二铵加样回收试验结果（n ＝9）Tab.2 Results of the recovery test of Diammonium Glycyrrhizinate for Injection（n ＝ 9）

2.4 样品含量测定

结果见表4。

表3 甘草酸二铵注射液加样回收试验结果（n ＝9）Tab.3 Results of the recovery test of Diammonium Glycyrrhizinate Injection（n ＝ 9）

表4 样品含量测定结果（%）Tab.4 Content determination of 18 α － glycyrrhizic acid and 18 β －glycyrrhizic acid in the samples（%）

3 讨论

3.1 流动相选择

预试验中，流动相考察了1%冰醋酸－甲醇，3%冰醋酸－甲醇－四氢呋喃，3%冰醋酸－乙腈－四氢呋喃和3%冰醋酸－乙腈－四氢呋喃（用氨水调pH 至8.0），结果18 α 甘草酸二铵和18 β 甘草酸二铵均不能达到完全分离。在流动相为水－60%高氯酸溶液（48 ∶0.5，V ／ V，用氨水调 pH 至 8.0） － 甲醇（48 ∶52，V ／ V）时，18 α 甘草酸二铵和 18 β 甘草酸二铵完全分离，检测出的杂质峰最多，且杂质分离效果最好。

3.2 18 α 甘草酸二铵和 18 β 甘草酸的组成比例

除f 企业注射液剂型中仅有18 β 甘草酸二铵外，其余厂家不同剂型样品均为18 α 甘草酸二铵和18 β 甘草酸二铵共存，比例为 2 ∶1 ～ 7 ∶1 不等。甘草酸二铵提取自中药甘草，2 种18 位差向异构体的比例不易控制，且由于现行标准中未对差向异构体的比例进行要求，故各厂家制剂中二者的组成也不尽相同。已有文献报道，不同比例的18 α 甘草酸二铵和18 β 甘草酸二铵制剂药理作用也不同［6－10］，因此亟须制订可行的方法控制其含量。