腊八蒜黄色素形成机制及稳定性研究进展

郭思文 ，赵晓燕，马越，张敏，赵煜炜，王丹*

1. 北京市农林科学院蔬菜研究中心、北京市果蔬农产品保鲜与加工重点实验室，农业农村部蔬菜产后处理重点实验室（北京 100097）；2. 沈阳农业大学食品学院（沈阳 110866）；3. 龙大食品集团有限公司（莱阳 265231）

大蒜属百合科葱属，2年生草本植物。大蒜营养成分非常丰富，含有多种生物活性物质，具有很高的营养价值和药用价值[1-2]。迄今为止，在大蒜中已发现200余种化合物[3]，目前认为含硫化合物是主要的生物活性物质，主要有二烯丙基一硫化合物、二烯丙基二硫化合物、二烯丙基三硫化合物等[4]。大蒜色变是蒜制品粗加工过程中常见的现象，打破休眠期的大蒜经机械破碎或一元有机弱酸处理后发生色变[5-6]，产生的是一种含氮的花青素类色素[7]。多年来，国内外相关学者对腊八蒜黄色素进行研究，但由于反应物质和色素组成的多样性和复杂性，其形成研究仍处于推测层面上，仍需更多的试验数据证明其具体的反应历程。研究发现，绿色素实际上由蓝色素和黄色素组成，蓝色素不稳定逐渐转化为黄色素[8]。在黄色素提取过程中，很多物质如粗蛋白、可溶性糖等溶出至浸泡液，分离难度较大[9]。因此结合各层析方法的特点，对腊八蒜黄色素进行分离纯化与鉴定。同时，腊八蒜黄色素作为一种潜在的色素资源，其稳定性是影响其开发与应用的主要因素。

目前对于腊八蒜黄色素研究甚少，结合前人的研究成果，论述腊八蒜黄色素形成机制，归纳腊八蒜黄色素分离纯化及鉴定的方法与进展，并分析影响腊八蒜黄色素稳定性因素，以期为中国大蒜的深加工产业和腊八蒜黄色素的开发利用提供理论基础。

1 腊八蒜黄色素形成的原理

自Cruss发现加入乙酸的蒜泥会产生绿色素，即大蒜绿变，已有70余年，至今其机理仍未阐明，而由绿色素转化的腊八蒜黄色素的形成途径，更是处于推测阶段。研究发现，腊八蒜绿色素不同于叶绿素及其他含卟啉类色素，而是一种含氮的花青素类色素，具有多个吡咯环，当吡咯环的聚合度增加时，其颜色由紫红向蓝、绿、黄方向改变。随着葱属植物研究的进一步深化，发现洋葱与大蒜的色变机制具有惊人的相似之处[10]。

1.1 大蒜的生理特性和处理方法对色变的影响

大蒜在较高温度下（22 ℃）具有休眠特性，一般为2～3个月[11]。大蒜的色变与贮藏温度有关，贮藏温度在22 ℃以上可有效防止大蒜在加工过程中色变现象的发生，新蒜也不会发生色变，只有在低温（12 ℃）条件下储藏一段时间的蒜才具有色变能力[12-13]，此过程是可逆的。在此期间大蒜中的多种化学成分发生变化，定义为大蒜打破休眠的过程。

最早发现大蒜的色变是在破碎的蒜瓣中，颜色变化过程是蓝→绿→黄。常规的大蒜色变有2种方式，一是机械破碎，即蒜泥的绿变，机械破碎会使存在于细胞质中的半胱氨酸亚砜底物与存在于液泡中的蒜酶接触，从而发生一系列化学反应而产生绿色素。研究发现，腊八蒜的色变与破碎程度直接相关，蒜瓣破碎得越细，色变越快[14]。二是醋酸浸泡，将大蒜鳞茎浸泡在醋酸中，通过改变细胞膜及液泡膜的通透性，从而使蒜酶与半胱氨酸亚砜接触，继而产生绿色素。白冰[6]采用具有与醋酸近似pKa值的一元有机弱酸（丙酸、丁酸、戊酸等）对大蒜进行浸泡处理，发现都具有使打破休眠期的大蒜变绿的能力，而二元或多远有机弱酸（苹果酸、柠檬酸等）则不能，这与一元有机弱酸的pKa值有关。一元弱酸在达到解离平衡过程中产生具有细胞毒性的中性分子，会非特异性地破坏液泡膜，从而产生一系列反应。多元有机酸如苹果酸和柠檬酸虽然可以改变细胞膜的通透性，但同时也是参加三羧酸循环的重要有机酸，所以植物细胞中具有调控这些多元有机酸的机制，从而不会破坏液泡膜，腊八蒜不会变绿。但无论是绿变的蒜泥或是蒜瓣，随着储藏时间延长，色变的过程都是由蓝绿色逐渐向黄色转化。

1.2 大蒜色变过程中化学成分的变化

在大蒜色变过程中，主要是酶和含硫化合物发挥作用，伴随着酶促反应和非酶反应。大蒜中含有多种酶类，包括γ-谷氨酰转肽酶、蒜氨酸酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶等。在低温贮藏（打破休眠）期间存在于大蒜鳞茎中的关键的含硫次生代谢产物是一类含硫非蛋白质氨基酸，即半胱氨酸亚砜[15-16]，如蒜氨酸、异蒜氨酸、环蒜氨酸等[17-18]。

研究表明，γ-谷氨酰转肽酶（GGT）在腊八蒜的变色过程中起到了重要的作用，GGT是生物体中普遍存在的酶，认为与次级代谢有关。江英等[19]发现γ-谷氨酰转肽酶（GGT）的活性与腊八蒜色变的变化是保持一致的，并且在大蒜变色的过程中作为水解酶存在，可以使蒜中的某种γ-谷氨肽水解[20]。由于GGT在低温下具有较高的活性，因此大蒜在低温储藏过程中，GGT可以通过切割γ-谷氨酰肽中的酰基部分生成相应的半胱氨酸[21]，而后在H2O2或氧化酶的作用下生成亚砜类物质[22]，如蒜氨酸（1-PeSCO）和异蒜氨酸（2-PeCSO）等[23-24]。研究表明，新鲜大蒜中PeCSO含量很低，经低温贮藏后在GGT的作用下含量升高，作为大蒜色变的重要因素之一，具有使不能色变的大蒜变色的能力，且色变程度与其含量呈正比。但在高温或碱性条件下，PeCSO会发生环化，产生环蒜氨酸，环蒜氨酸较为稳定[25]，且不参与大蒜的色变过程，这也是高温下大蒜不能产生色变的原因之一。

蒜氨酸裂解酶是葱属植物色变的前提，位于液泡中，具有Cβ-Sγ键裂解酶活性。以前的研究表明，由于大蒜中PeCSO和蒜酶分别存在于细胞的不同部位，因此大蒜的绿化只发生在加工大蒜中，如蒜泥或腊八蒜。这些处理是通过机械破碎或一元弱酸改变液泡膜通透性的原理使蒜氨酸裂解酶与细胞质中底物接触，从而将半胱氨酸亚砜裂解为二丙烯基硫代亚磺酸酯（色素中间体）和烯丙基硫代亚磺酸酯（大蒜素）[26]。

2004年，Kubec等[10]通过体外试验得出洋葱红变和大蒜绿变的色变前体都是含丙烯基的硫代亚磺酸酯。2005年，李蕾等[27]发现大蒜绿变能力同硫代亚磺酸酯含量呈正相关，此后研究发现随腊八蒜绿变程度加深，其内部硫代亚磺酸酯含量降低。为进一步证明硫代亚磺酸酯直接参与色素形成，向反应体系中添加半胱氨酸以消耗硫代亚磺酸酯，最终溶液中并无色素产生，认为硫代亚磺酸酯很可能参与色素形成的一系列反应。

1.3 腊八蒜黄色素的形成途径

随着研究的进一步深入，发现腊八蒜绿色素实际上是先生成蓝色素，蓝色素不稳定，对光、热敏感，随时间延长分解产生一种比蓝色素相对分子质量更小的黄色素，二者综合呈现出绿色。蓝色素和黄色素的紫外可见吸收峰分别在590和440 nm处[28]。有学者就腊八蒜黄色素的形成途径及化学结构式进行探讨，主要分为两部分：一是由蓝色素降解得到；二是由中间产物吡咯基氨基酸中间体和丙酮酸反应得到黄色素。

低温贮藏过程中γ-谷氨酰转肽酶活性增加，催化γ-谷氨酰肽，如γ-谷氨酰-S-烯丙基-L-半胱氨酸（GSAC）和谷氨酰-S-丙烯基-L-半胱氨酸（GSPC）转化为S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜（2-PeCSO）和S-丙烯基-L-半胱氨酸亚砜（1-PeCSO）。大蒜组织破损后，PeCSO在蒜酶的作用下分解为次磺酸和丙酮酸，次磺酸不稳定，进一步聚合生成相应的硫代亚磺酸酯[29]。Imai等[30]通过体外的模式反应提出吡咯基氨基酸可能作为大蒜绿变的中间体。经进一步研究，楠丁呼思勒等[31]发现在醋泡的新蒜中添加吡咯基缬氨酸后导致新蒜绿变，但游离氨基酸或吡咯则不具备此功能，由此证明吡咯基氨基酸作为大蒜绿变过程中的中间体。因此，丙烯基硫代亚磺酸酯和氨基酸反应生成吡咯基氨基酸中间体后，吡咯基氨基酸与烯丙基硫代亚磺酸酯结合生成蓝色素，蓝色素不稳定，降解为黄色素。

Bai等[32]、王丹等[33]通过Paal-Knorr反应以6种疏水链的氨基酸为原料合成吡咯基氨基酸模型物，通过体外试验与丙酮酸反应生成黄色素，该黄色素在418～460 nm范围内具有最大吸收，与腊八蒜黄色素的吸收相似。此外，腊八蒜色变的程度与吡咯基氨基酸结构有关，即模型化合物的侧链基团越小，产生的黄色素越多。此外，对吡咯基甘氨酸、吡咯基缬氨酸和吡咯基异亮氨酸与丙酮酸产生的黄色素的结构进行了鉴定，所产生的黄色素的紫外吸收峰分别在400.9，432.9和433.9 nm处有最大吸收，相对分子质量分别为300，384和412，它们都是2个吡咯环通过共轭双键的连接聚合而成的[34]。同样，在吡咯基天冬氨酸与丙酮酸的反应中同样观察到黄色素的产生，其结构与吡咯基缬氨酸与腊八蒜素产生的色素结构相似[30,35]。由此推测吡咯基氨基酸作为色素前体参与了腊八蒜黄色素的形成，与丙酮酸反应生成黄色素，且产生的黄色素结构相似。

2 腊八蒜黄色素分离纯化及结构表征

腊八蒜浸泡液或蒜泥长时间放置会变为黄色，对黄色素进行分离纯化并鉴定其结构对于腊八蒜黄色素的形成机理至关重要。目前通常采用柱层析、高效液相色谱法对腊八蒜黄色素进行分离提纯，并采用高分辨率质谱对其结构进行鉴定分析。

赵晓丹等对腊八蒜绿色素提取溶剂的选择、色素的极性、分离介质进行研究。结果表明，水、醋酸等极性较高的溶剂和非极性溶剂对色素的提取效果不佳，甲醇和95%乙醇对色素的提取效果较好，通过萃取溶剂的确定认为色素属于中等极性的物质。赵晓丹还对比了强离子交换树脂、弱离子交换树脂及不同极性的大孔吸附树脂，发现色素易于被极性树脂吸附，SIPI-40树脂对色素的吸附率最高。已知腊八蒜绿色素为黄色素和蓝色素的混合物，因此在此基础上建立提取分离腊八蒜黄色素的方法，根据色素极性采用甲醇作为黄色素提取溶剂，经真空浓缩除去甲醇后，得到乳状色素提取液，使用乙酸乙酯进行萃取。而后经大孔吸附树脂SIPI-40、Sephadex LH-20凝胶层析和C18固相微萃取分离精制，再通过高效液相色谱进一步分离，得到腊八蒜黄色素。

司君伟[36]研究发现，得到的黄色素并非一种物质，而是由不同黄色素组成，推断黄色素可能含有183 Da的物质，但对于提取出的物质没有进一步解离及电子轰击进行鉴定。另外，在使用Amberlite CG-50分离蓝色素时，发现部分黄色素也被洗脱下来，由此得到黄色素与蓝色素的极性相似，且相对分子质量小于蓝色素，推测这部分黄色素可能是蓝色素向黄色素转化的最初黄色素形态。

Wang等[7]在模拟体系中使用吡咯基甘氨酸、吡咯基缬氨酸、吡咯基异亮氨酸分别与丙酮酸反应产生黄色素，通过固相微萃取、液质联机、高分辨率质谱、多级质谱分离纯化鉴定此色素，阐明其分子组成并推测化学结构、质谱碎片裂解机理及形成机理。其中吡咯基甘氨酸与丙酮酸产生2种黄色素，紫外吸收光谱分别为436.9和400.9 nm，相对分子质量分别为328和300，相应的分子式为C18H20N2O4和C16H16N2O4，都是两摩尔的2-吡咯基乙酸通过共轭双键的连接聚合生成的，但相对分子质量328的色素较相对分子质量为300的在连接两摩尔的吡咯基甘氨酸的基团上多了2个甲基。由吡咯基缬氨酸和吡咯基异亮氨酸与丙酮酸反应产生的黄色素的紫外吸收光谱分别为432.9和433.9 nm，相对分子质量分别为384和412，相应的分子式为C22H28N2O4和C24H32N2O4，是两摩尔的吡咯基缬氨酸或两摩尔的吡咯基异亮氨酸通过共轭双键的连接聚合生成的。

国内外对于腊八蒜黄色素这种未知结构的色素研究较少，Wang等[7]通过人工合成的黄色素结构的鉴定，进一步证实前人提出的吡咯基氨基酸作为“腊八蒜”色素中间体这一假设的正确性，并为今后研究真实体系中黄色素形成奠定基础。

3 腊八蒜黄色素稳定性的研究进展

腊八蒜黄色素作为天然色素，在提取和应用过程中的稳定性备受关注。白冰[6]在蒜泥浸提液中发现，黄色素在常温（25 ℃）储藏期间其吸光度呈先上升后下降趋势。随着研究深入，赵晓丹等[37]对于腊八蒜黄色素的稳定性进行探讨。

3.1 温度

研究发现，腊八蒜黄色素对热敏感，热处理时温度越高，色素损失越大。研究表明，加热处理会加快腊八蒜蓝色素向黄色素的转化[38]。高温（大于80 ℃）加热，会使黄色素受到较大破坏。

3.2 pH

腊八蒜黄色素在酸性条件下较为稳定，但过酸（pH＜3）或偏中性条件会加快色素分解，碱性条件下色素分解得更快。赵晓丹等[37]发现当把碱性的色素溶液用酸溶液重新调至酸性pH时，色素变化具有可逆性，但吸光度有所降低。这可能是由于pH的改变影响色素的呈色基团结构，从而使色素的显色受影响，并且这种影响是可逆的。

3.3 光照

很多天然色素在自然光照射下会褪色，研究发现腊八蒜黄色素损失率随着光照时间增加缓慢增加。30 d后，经光照处理的黄色素的损失率约9.3%，未经光照的黄色素损失率约为4%。由此可见，光照对腊八蒜黄色素稳定性有一定影响，但影响不大。

3.4 氧化剂和还原剂

过氧化氢和亚硫酸钠作为一种常见的强氧化剂和还原剂，以不同浓度与腊八蒜黄色素溶液混合，反应一段时间后，腊八蒜黄色素吸光度显示出一定的剂量依赖性。在过氧化氢和亚硫酸钠浓度为1.5%时，腊八蒜黄色素的损失率分别达到22.8%和81.4%，由此可见，氧化剂和还原剂都会严重影响腊八蒜黄色素的稳定性。

3.5 金属离子

一些具有金属离子活性的副族金属离子也会影响色素的稳定性，使色素发生褪色或沉淀[39]。在酸性条件下向腊八蒜黄色素溶液中加入不同的金属离子，发现Cu2+，Zn2+，Al3+，Mn2+，Fe2+对黄色素的稳定性无显著影响，而加入Fe3+的黄色素吸光度略有增加。

3.6 食品添加剂

天然色素稳定性普遍较差，使用食品中常用的抗氧化剂维生素C和防腐剂山梨酸钾添加到腊八蒜黄色素中，以期在实际生产中将食品添加剂应用于腊八蒜黄色素中。结果发现，与对照相比，在维生素C的存在下，腊八蒜黄色素随放置时间延长，其损失率不断增加。而添加山梨酸钾（添加量＜1%）对黄色素无显著影响。由此说明在腊八蒜黄色素过程中应尽量避免使用维生素C，可以适量与山梨酸钾共用。

因此，腊八蒜黄色素应尽量处于低温、避光、酸性条件下进行贮藏，并避免与维生素C、氧化剂和还原剂接触。色素的稳定性对于开发应用至关重要，目前对于提高腊八蒜黄色素稳定化方法研究较少。天然色素常采用色素稳定剂、酰基化改造和微胶囊化技术等[40-42]提高稳定性，对于提高腊八蒜黄色素稳定性的调控技术以及进一步应用还有待探讨。

4 展望

虽然目前对于腊八蒜黄色素的化学结构及形成途径是通过模拟体系推测得出，但通过模拟体系合成黄色素的方法对研究真实体系中的腊八蒜黄色素具有重要意义。另外，就腊八蒜黄色素稳定性的研究表明，黄色素的稳定性较好，具有一定的应用可能性。在此基础上未来可以考虑对腊八蒜黄色素进行开发利用，明确其生物活性和吸收转运机制，为功能性天然色素的开发利用及大蒜产业的发展提供理论基础。