食品中γ-谷氨酰肽的研究进展

◎ 林 顺，刘 希，王琦文，童 星

（1.佛山市海天（高明）调味食品有限公司，广东 佛山 528511；2.广东海天创新技术有限公司，广东 佛山 528000）

γ-谷氨酰肽是由谷氨酰胺或谷氨酸的γ-羧基和氨基酸或肽分子的α-氨基发生脱水缩合反应所得的一类小分子肽，广泛存在于自然界中[1]。研究者在不同食物中也发现了新的γ-谷氨酰肽，如酱油、大豆、奶酪、大蒜、洋葱、鱼制品和酵母抽提物[2]。在19 世纪90 年代，人们发现γ-谷氨酰肽是赋予这些食物浓厚风味（口感饱满、连续性和持续性）的主要贡献成分[3]，这也引发了学术界对γ-谷氨酰肽感官特性的各种研究。2010 年，OHSU 等[4]报道了γ-谷氨酰肽是细胞外钙敏感受体（Calcium-Sensing Receptor，CaSR）激动剂，可以间接增强kokumi 味觉感受。除了味觉作用之外，人们还研究了γ-谷氨酰肽参与人体生理活性的多种机制，发现其具有抗炎[5]、抗氧化[6]、抗肿瘤[7]、降血压、调节心血管系统以及金属离子螯合[8]作用等，使人们进一步认识到了γ-谷氨酰肽的功能与价值[9]。

1 γ-谷氨酰肽的生理活性

1.1 激活kokumi 风味感知

CaSR 激活剂包括肽、氨基酸、多胺、阳离子和氨基糖苷类抗生素[8]。BROADHEAD 等[9]提出CaSR的细胞外捕蝇草结构域是γ-谷氨酰肽的结合位点，这种结合导致细胞内Ca2+水平升高，产生kokumi 味觉的神经信号。很多研究表明CaSR 的活性与γ-谷氨酰肽的kokumi 强度呈正相关[10]。有研究者使用非洲爪蛙卵母细胞和人胚胎肾（HEK）-293 细胞测试了近百种γ-谷氨酰肽的CaSR 活性及其kokumi 味觉强度，进一步证实了γ-谷氨酰肽的结构特征能够激活CaSR，并引发kokumi 感觉[11]。引起高CaSR 活性和醇厚味的肽通常在N 端具有γ-谷氨酰基，在第二个残基处具有脂肪族、中性、中等大小的取代基，并且优选在C 端为甘氨酸的羧基[12]。

1.2 抗炎活性

γ-谷氨酰肽在人体中表现出各种类型的抗炎作用。例如，有研究者将膳食二肽γ-谷氨酰缬氨酸（γ-EV）和γ-谷氨酰半胱氨酸（γ-EC）鉴定为具有健康促进因子的抗炎肽。其中γ-EV 和γ-EC可 改善葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎症、结肠缩短、体重减轻和组织学损伤引起的临床症状[13]。γ-EC 能够保护Wistar 大鼠的肝组织免受镉和铁诱导的肝细胞损伤，增加肝组织中的抗氧化能力，减少促炎细胞因子，增加抗炎细胞因子，进而可以调节人体代谢疾病的发生[5-6]。

1.3 改善血糖

二肽基肽酶（Dipeptidyl Peptidase-4，DPP-4）广泛存在于人和动物体内，是一种丝氨酸水解酶，可水解各种肽，包括生长激素释放激素、肠神经肽、胃泌素释放肽和肠促胰岛素[14]，其中肠促胰岛素会导致血糖升高，因此被认为是针对2 型糖尿病的潜在治疗靶点。目前，许多研究人员专注于寻找可以成为有效DPP-4 抑制剂的新型化合物，通过阻止DPP-4 分解胰高血糖素样肽-1（Glucagon-Like Peptide-1，GLP-1），进而提高GLP-1 的水平，发挥控制血糖作用，是目前治疗糖尿病的主攻方向之一。例如，有研究筛选了21 种γ-谷氨酰二肽的DPP-4 抑制活性，其中γ-Glu-Met、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Trp、γ-Glu-Leu和γ-Glu-Tyr 被发现对DPP-4 表现出竞争性抑制作用[15]，γ-谷氨酰肽也被证明可以以CaSR 依赖的方式改善餐后血糖[16]。

1.4 调节胆囊收缩素和抑制食欲活动

胆囊收缩素（Cholecystokinin，CCK）是一种肠脑肽激素，参与刺激蛋白质和脂肪的消化。它由胃肠道十二指肠细胞分泌，还参与胰腺生长、胃肠蠕动和抑制胃酸分泌，有助于抑制食欲，从而减少食物摄入。因此，CCK 是控制和预防肥胖的有效治疗靶点。包括γ-Glu-Cys-Gly、γ-Glu-Cys 和γ-Glu-Ala 在内的γ-谷氨酰肽可通过变构调节CaSR，增加细胞内cAMP的浓度[9]。因此，γ-谷氨酰肽具有调节肠道激素的巨大潜力，能够抑制食欲和控制食物摄入。

1.5 其他生物活动

SCV-07（γ-Glu-Trp）是一种新型免疫调节肽，具有抗结核病的广谱免疫调节活性，能够减轻口腔黏膜炎症状[17]。γ-谷氨酰肽也存在于人体中，它们在体内的积累增加可能与疾病的发作有关，因此可以作为诊断某些疾病的指标。据报道，神经组织中γ-Glu-Lys的积累增加是神经系统疾病的诊断指标[18]。

2 γ-谷氨酰肽的提取和分离

γ-谷氨酰肽在很多食物中都存在，并且对这些食物浓厚、持续、复杂的口感有重要贡献，很多研究者对其进行了分离和鉴定。UEDA 等[19]使用Duolite C-25 离子交换树脂和反渗透膜提取分离了大蒜中的kokumi 关键呈味物质，然后使用质谱和核磁共振对该物质进行了鉴定，结果为(+)-S-甲基-L-半胱氨酸亚砜和γ-L-谷氨酰胺-S-烯丙基-L-半胱氨酸。该研究团队还采用水提和乙醇提取方法分析发现了PeCSO和γ-Glu-PeCSO，并证实其为洋葱特有醇厚风味的重要组成[3]。ROUDOT-ALGARON 等[20]采用液体CO2沉淀及柠檬酸盐缓冲液分离，然后使用凝胶渗透色谱法和反相高效液相色谱纯化，并通过质谱法进行分析，确定kokumi 风味的主要贡献物为γ-Glu-Leu、γ-Glu-Tyr 和γ-Glu-Phe。另外一些研究应用超滤、凝胶过滤色谱和高效液相色谱的组合从干鲱鱼片、大豆种子和牛骨髓的水提取物中纯化γ-谷氨酰肽[21-23]。

3 γ-谷氨酰肽合成

虽然γ-谷氨酰肽存在于多种食物中，但是含量太低，且提取分离的成本很高，因此采用生物合成法是获取大量γ-谷氨酰肽最经济、有利的途径。γ-谷氨酰肽的生物合成主要利用酶的催化作用和微生物发酵实现，目前文献报道的可以催化合成γ-谷氨酰肽的酶主要包括谷氨酰转肽酶（EC 2.3.2.2）、谷氨酰胺酶（EC 3.5.1.2）、谷氨酰半胱氨酸合成酶（EC 6.3.2.2）[8]。

3.1 γ-谷氨酰肽生物合成

3.1.1 γ-谷氨酰转肽酶

γ-谷氨酰转肽酶（Gamma-Glutamyltransferase，GGT）是一个异二聚体，具有分子量大小不同的两个亚基，属于N-末端亲核氨基水解酶类，可催化γ-谷氨酰基的转移反应和谷氨酰胺的水解反应。发生反应时，γ-谷氨酰转移酶小亚基N-末端苏氨酸的活性氧原子攻击γ-谷氨酰基供体形成γ-谷氨酰-酶复合体，当亲核试剂为氨基酸或肽分子时发生转肽反应，为水分子时发生水解反应，当供体肽的第二个底物充当受体，则被称为自转肽（图1）[8]。由于这两种反应的最佳pH 值不同，酶可以选择性地催化其中一种反应。利用不同的氨基酸作为γ-谷氨酰受体，可以合成各种γ-谷氨酰肽。例如，SUZUKI 等[1]采用大肠杆菌生产的GGT 合成了γ-Glu-Val、γ-Glu-Gln、γ-Glu-Phe、γ-Glu-Trp、γ-谷氨酰乙酰胺。该研究者还将GGT 用于Phe、Val、Leu 和His 的γ-谷氨酰基化以降低其苦味，并发现催化合成γ-Glu-Phe 的最佳反应条件为Gln 200 mmol·L-1、Phe 200 mmol·L-1、GGT 0.5 U·mL-1、pH 值为10.4、37 ℃孵育1.5 h，该条件下可得到140 mmol·L-1γ-Glu-Phe，产率为70%。对于大规模工业应用，通常会优选GGT，这是因为GGT 不需要使用ATP 进行转移反应。此外，细菌GGT 已被证明比哺乳动物GGT 更有益，因为它们具有非糖基化蛋白质、更高的溶解度和更广泛的底物选择性，与哺乳动物GGT 相比，细菌GGT 能够产生多种γ-谷氨酰化合物。此外，哺乳动物GGT 需要使用谷胱甘肽作为γ-谷氨酰供体，而细菌GGT 可以使用廉价的谷氨酰胺。细菌GGT 对生产药学相关肽也很重要，如通过大肠杆菌GGT 合成的γ-L-谷氨酰-二羟基苯丙氨酸已被证明是一种有前途的帕金森病治疗药物，其能够增加大脑中的多巴胺水平[24]。大肠杆菌GGT 也被用于以L-谷氨酰胺为供体合成γ-谷氨酰牛磺酸和γ-Glu-Trp，对鼠结核病具有免疫调节作用[25]。

图1 不同酶合成γ-谷氨酰肽作用机制图

3.1.2 谷氨酰胺酶

谷氨酰胺酶是一种水解酶，广泛存在于酵母、细菌和真菌等微生物中，主要催化谷氨酰胺水解成谷氨酸。然而，某些谷氨酰胺酶也可以催化γ-谷氨酰部分从谷氨酰胺转移到各种肽或氨基酸以产生γ-谷氨酰肽（图1）[26]。YANG 等[27]验证了解淀粉芽孢杆菌（GBA）和米曲霉（GAO）谷氨酰胺酶产生γ-[Glu]n-Phe 肽的转肽酶活性。在Gln 和Phe 的存在下，GAO 合成了γ-Glu-Phe 和γ-Glu-γ-Glu-Phe，GBA合成了γ-[Glu](1 ≤n＜5)-Phe，GBA 在转肽反应中对Phe和γ-Glu-Phe的亲和力大于GAO。合成γ-[Glu]n-Phe 的最佳条件是pH=10，合成温度37 ℃，底物为300 mmol·L-1Gln、100 mmol·L-1Phe 和0.05 U·mL-1GBA，保温时间3 h[28]。TACHIKI 等[29]采用硝基还原假单胞菌（Pseudomonas nitroreducens）源的谷氨酰胺酶，可催化谷氨酰胺中的γ-谷氨酰部分转移到甲基或者乙基上，进而合成了茶氨酸。然而，与GGT 相比，γ-谷氨酰转移酶有限的活性和较窄的底物特异性，导致谷氨酰胺酶通常不是工业应用的首选酶。

3.1.3 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-Glutamylcysteine Synthetase，γ-GCS）通过连接谷氨酸与半胱氨酸，在谷胱甘肽合成反应中催化γ-谷氨酰-半胱氨酸的合成。该酶还能催化其他氨基酸与谷氨酸反应，生成不同的γ-谷氨酰肽（图1）[30]。KOBAYASHI 等[30]报道了在GCS 催化活性中，半胱氨酸的Km值最低，为0.06 mmol·L-1，而其他氨基酸的Km值则更高，为21～1 800 mmol·L-1。表明在产生γ-谷氨酰肽过程中，除半胱氨酸外，其他氨基酸不是GCS 受体的首选。NAKAYAMA 等[31]研究发现，从奇异变形杆菌中纯化的GCS 能够合成不同的γ-谷氨酰肽，包括γ-Glu-Val、γ-Glu-Cys、γ-Glu-Ser、γ-Glu-Abu、γ-Glu-Lys和γ-Glu-Ala 等，该酶的最佳催化条件为温度30 ℃、pH=8.5 孵育24 h。然而，该酶的局限性在于需要ATP进行催化，并且在反应过程中产生的ADP 和最终反应产物可能通过反馈抑制机制导致产率降低[32]。

3.2 γ-谷氨酰肽微生物发酵

许多发酵食品都会积累γ-谷氨酰肽，这归因于原料中微生物或酶的代谢活动。例如，谷物发酵中的谷胱甘肽是微生物内部谷胱甘肽还原酶的催化作用产生的[33]。有研究人员在酵母自溶物中发现了谷胱甘肽[34]。XIE 等[35]利用罗伊氏乳杆菌γ-谷氨酰半胱氨酸连接酶（Glutamate Cysteine Ligase，GCL）的活性，从以14 种氨基酸为底物的体系中合成了γ-谷氨酰肽，包括γ-Glu-Ala、γ-Glu-Met、γ-Glu-Glu、γ-Glu-Gln、γ-Glu-Leu、γ-Glu-Ile 和γ-Glu-Phe等。SOFYANOVICH 等[36]报道了在酵母提取物中发现的γ-EVG 是由酿酒酵母通过两种途径合成得到：以谷氨酸、缬氨酸和甘氨酸作为前体，由GCL 和GS 酶的催化作用产生；通过（Dug2p-Dug3p）2 复合物介导γ-谷氨酰部分从谷胱甘肽转移到二肽Val-Gly 上产生γ-EVG。然而，由微生物发酵作用产生的γ-谷氨酰肽浓度较低，提取和纯化的成本比较高。

4 结语

γ-谷氨酰肽广泛存在于天然动植物及日常食物中，不仅可以改善食品的风味，提升浓厚感，还具有抗炎、抗氧化、降血压以及心血管系统调节等多方面的生理作用，在食品风味提升及天然健康物质合成方面有着巨大的应用价值。但是，目前除了谷胱甘肽具备工业化基础之外，其他结构及功能的γ-谷氨酰肽仍然缺少高效成熟的生产技术，其在合成过程中仍存在以下科学难题急需解决。①谷氨酰胺酶受体的转移活性较低，谷氨酰转肽酶催化效率仍处于实验室水平，需要通过酶工程和细胞工程技术构建γ-谷氨酰肽催化酶剂的高效表达。②通过基因工程改造载体细胞，优化代谢通路，实现微生物发酵生产γ-谷氨酰肽的工业化可行路线。③γ-谷氨酰肽通过激活味觉中CaSR 达到增强浓厚感的效果，但其深层的分子作用机制尚不清楚，对于浓厚感风味具有协同作用的物质缺少相关研究。所以，加强γ-谷氨酰肽的深入研究对未来健康食品行业的发展具有重要意义。