UPLC-MS/MS 法测定猪肉中氯霉素残留量的不确定度分析

◎ 宋春雪

(盘锦检验检测中心，辽宁 盘锦 124000）

氯霉素是抗生素的一种，用来治疗水产以及畜禽等动物与细菌相关的各种疾病，药性较好，作用显著，但其会残留在动物体内。人们长期食用含有此类药物的食品，可能罹患血液疾病[1]。因此，与氯霉素相关的药物已成为兽药残留必检的项目[2]。目前，检测氯霉素的方法有液相色谱法、气相色谱法、超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）[3]。其中，检测相同浓度的氯霉素时，使用超高效液相色谱-串联质谱法检测具有灵敏度、准确度和精密度更高的特点[4]。由于动物源性食品成分复杂，为使检测结果更可信，对不确定度进行测量评定非常有必要[5]。本文深入探讨使用UPLC-MS/MS 检测猪肉中氯霉素残留量时的各种影响因素，并对这些影响因素进行分析，为其他相关联兽药残留量测量提供相关资料。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

AB4000QTRAP 液质联用仪（AB 公司）；FA2004N电子天平（上海精密仪器有限公司）；VORTEX-6 型旋涡仪（其林贝尔公司）；HSC-24B 氮吹仪（恒奥科技发展有限公司）；RV10 型旋转蒸发仪（IKA）；Z36HK型高速离心机（其林贝尔公司）。

1.2 材料与试剂

猪肉为当地市售商品，来源于新发地批发市场。

LC-Si 固相萃取柱（200 mg，3 mL，逗点公司）；微孔滤膜（0.22 μm，Agilent）；正己烷（色谱纯，Fisher）；甲醇（色谱纯，Fisher）；丙酮（色谱纯，Fisher）；乙腈（色谱纯，Fisher）；正丙醇（分析纯，国药）；标准品：氯霉素（纯度为99.3%，不确定度为0.03%，k=2，德国Dr）、氯霉素-D5（浓度为100 μg·mL-1，不确定度为1.2%，k=2，德国Dr）。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

根据国标GB/T 22338—2008 中3.4 部分进行样品制备与保存，3.5 部分进行样品提取与净化。

1.3.2 仪器条件

（1）色谱条件。色谱柱：Waters C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流速：0.3 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样体积：5 μL；流动相：A 相为乙腈，B 相为10 mmol·L-1乙酸铵溶液。梯度洗脱程序：0 min，10% A；1.00 min，10% A；2.50 min，90% A；5.50 min，90% A；5.51 min，10% A；7.00 min，10% A。

（2）质谱条件。电离方式：ESI-；检测模式：多反应监测；离子电压：-4 500 V；离子源温度：550 ℃；其扫描采集参数见表1。

2 结果与分析

2.1 不确定度来源分析

根据测定过程，分析了影响结果的各种分量的来源，主要包括4 方面内容。①重复性测量。②样品称量过程。③样品定容过程（包括定容过程中温度变化）。④标准物质的纯度、标准溶液配制及标准曲线拟合。

2.2 不确定度的评定

2.2.1 测量结果重复性引入的相对标准不确定度urel(rep)

对样品进行6 次平行测量，测得氯霉素含量xi分别为1.92 μg·kg-1、1.90 μg·kg-1、1.94 μg·kg-1、1.89 μg·kg-1、1.84 μg·kg-1和1.86 μg·kg-1，平行测定结果的平均值为1.89 μg·kg-1。

单次测定的标准偏差为

测量结果重复性引入的相对标准不确定度为

2.2.2 样品称量过程引入的相对标准不确定度urel(m)

用分析天平称取5.000 g 样品，称量的最大允许误，则样品称量过程引入的相对标准不确定度为差为0.1 mg，按均匀分布处理

2.2.3 样品定容过程引入的相对标准不确定度urel(V)

用A 级刻度吸管吸取5 mL 丙酮-正己烷（体积比为1∶9），其允差为±0.025 mL，按均匀分布处理，其相对标准不确定度为

样品最终用1 mL A 级刻度吸管定容并上样分析，其允差为±0.008 mL，按均匀分布处理其相对标准不确定度为

综上，可得样品定容过程引入的相对标准不确定度为

2.2.4 标准物质的纯度、标准溶液配制及标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel(C)

（1）标准物质的纯度引入的不确定度。由标准物质信息可知氯霉素外标纯度引入的不确定度为0.03%（k=2）；氯霉素内标纯度引入的不确定度为1.2%（k=2），则氯霉素外标、内标纯度引入的相对标准不确定度分别为

（2）标准溶液配制过程引入的不确定度。①1 mg·mL-1氯霉素配制过程：准确称取氯霉素标准品物质0.010 07 g，用甲醇溶解、定容至（10±0.02）mL容量瓶。标准物质的称量和定容引入的相对标准不确定度分别为

1 μg·mL-1氯霉素-D5标准储备液配制过程为精密吸取氯霉素-D5内标（100±1）μL 于（10±0.02）mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。标准物质的吸取和定容引入的相对标准不确定度分别为

②标准中间液引入的不确定度。1 μg·mL-1氯霉素标准中间液配制过程为精密吸取氯霉素标准储备液（100±1）μL 于（100±0.10）mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。标准物质的吸取和定容引入的相对标准不确定度分别为

③标准工作液引入的不确定度。100 ng·mL-1氯霉素标准工作液配制过程为精密吸取氯霉素标准中间液（1 000±10）μL 于（10±0.02）mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。标准物质的吸取和定容引入的相对标准不确定度分别为

100 ng·mL-1氯霉素-D5标准工作液配制过程为精密吸取氯霉素D5标准储备液（1 000±10）μL 于（10±0.02）mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。标准物质的吸取和定容引入的相对标准不确定度分别为

④混合标准工作液引入的不确定度。准确吸取100 ng·mL-1氯 霉素标准工 作液（200±2）μL，100 ng·mL-1氯霉素-D5标准工作液（500±5）μL，用空白基质液稀释、定容至（10±0.02）mL 容量瓶中，配成标准工作液的浓度为2 ng·mL-1，内标为5 ng·mL-1。

则吸取（200±2）μL 氯霉素标准工作液引入的相对标准不确定度为

将（200±2）μL 氯霉素标准工作液定容到（10±0.02）mL 容量瓶引入的相对标准不确定度为

吸取（500±5）μL 氯霉素-D5标准工作液引入的相对标准不确定度为

将（500±5）μL 氯霉素-D5标准工作液定容到（10±0.02）mL 容量瓶引入的相对标准不确定度为

（3）温度变化引入的不确定度。上述标准溶液配制过程中用到了10 mL 和100 mL 容量瓶，在使用容量瓶过程中，温度的变化也会导致容量瓶体积的微量变化，导致不确定度的引入。假设室温有3 ℃差异（ΔT=3），液体膨胀系数ρ=1.18×10-3/℃，则温度变化引入的相对标准不确定度分别为

（4）标准曲线拟合引入的不确定度（最小二乘法拟合）。用配制的混合标准工作液上机测定3 次，得到的峰面积比分别为0.673、0.664、0.654，则平均峰面积比为0.664，标准曲线为y=0.332x，r=0.999 9。标准曲线剩余标准差计算为

式中：yi为各个标准溶液浓度对应的响应值；y为根据标准曲线算出的理论响应值；n为标准曲线的点数（由于每个点测3 次，n=3）。

标准曲线拟合引入的标准不确定度为

则标准曲线拟合引入的相对标准不确定度为

综上，标准物质的纯度、标准溶液配制及标准曲线拟合引入的相对标准不确定度为

2.2.5 合成不确定度

将各不确定度分量汇总，合成不确定度为

2.2.6 扩展不确定度及结果表示

3 结论

本文使用UPLC-MS/MS 法检测了猪肉中氯霉素的残留量，建立了特定的数学模型，并用此模型对不确定度进行了计算、模拟和评估。在整个的实验过程中，能够引入不确定度的过程很多，包括称量、提取、净化、质谱测定等。本实验从标准系列溶液配制、样品前处理、样品重复测定、标准曲线拟合这4 个方面分析评定引入的不确定度。结果表明，标准溶液配制、标准曲线拟合这2 个步骤引入的不确定度分量最大，其次是体积量取和测量重复性这2 个过程。因此，可以通过提高标准品纯度、对前处理各步骤进行优化、增加测定重复次数、提高UPLC-MS/MS 灵敏度、对所用到的仪器定期进行检定以及不断提高化验员的实验水平等方式对测量不确定度进行控制，以确保检测结果的准确性。