肖建平 ,许惠凤 ,周 奕 ,张诗琪 ,王丽丽 ,叶蕻芝
(1.福建中医药大学附属康复医院,福建 福州350003)(2.福建省康复技术重点实验室,福建 福州350003)(3.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室,福建 福州350122)(4.福建中医药大学药学院,福建 福州 350122)
中药材是中医发挥疗效的主要物质基础,中药材安全问题是关系到服药安全和疗效保证的重要问题。然而中药材在存放或者运输时极易发生变质腐烂,产生以真菌毒素为主的致毒物质[1-2]。在现已发现的真菌毒素中,赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)以毒性最大、平均产毒量最高、分布最广泛、污染最严重被广泛关注[3],因此,对OTA含量的灵敏检测具有重要的意义。
1.1 主 要 试 剂 NaHCO3、Tris、KCl、NaCl、MgCl2、CaCl2、HCl、甲醇等购自国药集团(上海)化学试剂有限公司;OTA、赭曲霉毒素 B(ochratoxin B,OTB)、黄曲霉毒素B1(AFB1)等购自美国Sigma公司;1.24μM OTA标准储备液用甲醇配制,4℃冰箱密封保存备用;实验所用化学药品的纯度均达到分析纯级别;实验用水均为Millipore Milli-Q系统净化的超纯水(电阻为18.2 MΩ);实验所用DNA序列为一端标记有羧基荧光素(FAM)的OTA适配体:5'-GATCGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-FAM-3',该序列交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
1.2 主要仪器 透射电子显微镜(美国FEI公司,型号:TECNAI G2F20);荧光分光光度计(美国 Varian公司,型号:Cary Eclipse);紫外-可见分光光度计(日本岛津公司,型号:UV1800);管式炉(合肥科晶材料技术有限公司,型号:GSL 1400X);酸度计(上海越平科学仪器有限公司,型号:PHS-3C);微量高速离心机(美国 Thermo公司,型号:Micro17R);恒温金属浴(杭州米欧仪器有限公司,型号:DKT-100)。
2.1 氮化碳纳米片(g-C3N4nanosheets,CNNS)的合成制备 首先合成体相的g-C3N4:将3 g二氰胺放置在管式炉中,以约3℃/min的速率进行程序升温并在600℃下加热2 h,得到淡黄色的体相g-C3N4。接着制备 CNNS:100 mg的体相 g-C3N4粉末研磨后,分散在100 mL水中并超声16 h;接着,将形成的混悬液以约6 000 rmp转速离心5 min,除去残留的未分散的g-C3N4;最后,收集上清液,并在60℃下在旋转蒸发器中减压浓缩,获得牛奶状悬浊液。CNNS悬浊液的质量浓度通过称量一定体积悬浮液干燥后的CNNS质量来计算。
2.2 CNNS的形貌观察 将所合成的CNNS悬浊液均匀滴加在超薄碳膜上,待干燥后在透射电子显微镜下放大至标尺为50 nm条件时观察其表面形貌。
2.3 OTA适配体母液的制备 把1 OD的OTA适配体放入超高速离心机以10 000 rpm离心5 min,待取出后加入270μL的蒸馏水,充分混匀配成浓度为10μM母液;之后将该母液放入金属恒温加热器中,在90℃下解链5 min;完毕后将该溶液取出,缓慢降至室温,备用。
2.4 荧光光谱的测定 取2μL 10μM OTA适配体溶液与适量OTA(总体积 198μL)充分混合后37℃下反应 180 min,之后加入 2μL 100 μg/mL 的CNNS悬浊液振荡混匀,静置2 min后进行荧光检测。荧光参数为:激发波长490 nm,发射波长扫描范围500~650 nm,激发狭缝5 nm,发射狭缝5 nm。
3.1 CNNS的形貌表征 从透射电镜图中可以看出,实验所制备的CNNS为平面层状且带有褶皱的纳米片层,且几乎透明,表明其具有超薄的片状结构。见图1。
图1 CNNS的透射电镜图
3.2 CNNS含量对含有OTA和不含OTA溶液的荧光强度影响 分别往含有OTA和不含OTA溶液中加入不同浓度的CNNS,可以看出2组溶液的荧光强度均随着CNNS用量的增加而降低,且不含OTA溶液的下降幅度明显大于含有OTA溶液。当CNNS用量为1μg/mL时,2组溶液的荧光强度差异值达到最大。见图2。
图2 不同CNNS含量下的荧光强度对比图
3.3 CNNS加入时长对含有OTA和不含OTA溶液的荧光强度影响 当1μg/mL CNNS加入到不含有OTA的适配体溶液后,该溶液的荧光信号迅速被淬灭。而当同浓度CNNS加入到含有OTA的适配体溶液后,其荧光强度降幅明显变小,且在CNNS加入2 min后,该荧光强度与溶液中不含OTA时的强度差异值达到最高。见图3。
图3 不同CNNS加入时长的荧光强度对比图
3.4 OTA与其适配体的反应时长对溶液的荧光强度影响 实验考察了OTA与其适配体在不同反应时间下的荧光强度情况,从图4可以看出,随着目标物OTA与其适配体的作用时间延长,溶液的荧光强度也逐渐增强。当两者反应时间达到180 min后,溶液的荧光强度达到最高。见图4。
图4 OTA和其适配体不同反应时间下的荧光强度对比图
3.5 不同OTA浓度下的荧光光谱 在上述最佳实验条件下,实验进一步记录了在不同OTA浓度下溶液的荧光光谱图。从图5中可以看出,溶液荧光强度随着OTA浓度的增加而变大。见图5。
图5 不同OTA浓度下的荧光光谱图
3.6 标准曲线的建立 实验在上述荧光光谱结果的基础上建立了OTA检测的标准曲线,线性方程为:I/a.u.=151.77 log COTA /nM+101.51(相关系数 r=0.991 9),线性范围为 1~100 nM,检测限为0.7 nM(S/N=3)。 见图 6。
图6 OTA标准曲线
3.7 主要干扰物质的影响情况 实验考察了OTB和AFB1在相同条件下的荧光信号响应。结果由荧光强度改变量来衡量,其定义为溶液在加入待测毒素之前和之后的荧光信号强度差值。结果显示:OTA的存在会引起非常明显的荧光信号改变,而10倍浓度的其它两种毒素存在时溶液的荧光改变值并不明显;另外,将三种毒素混合一起测定时,溶液荧光强度的改变和单纯OTA的情况非常接近。见图7。
图7 不同毒素存在时溶液的荧光强度对比图
我国现有的OTA检验方法主要有免疫亲和层析净化液相色谱法、离子交换固相萃取柱净化高效液相色谱法、免疫亲和层析净化液相色谱-串联质谱法、酶联免疫吸附测定法和薄层色谱测定法等[4-7]。这些方法所用色谱、质谱等检测仪器比较复杂、昂贵,局限于实验室检测,而快检中的薄层色谱等方法的检测灵敏度又相对低下,因此,很有必要进一步探索新的灵敏简便的检测方法。荧光分析法以灵敏度高、选择性强和使用简便受到广泛的关注,目前已经发展成为一种十分重要且有效的光谱化学分析手段[8]。本实验结合荧光分析法的高灵敏度和核酸适配体的特异性识别能力来建立新的OTA检测方法。
核酸适配体(aptamer)是一段由25~80个RNA或DNA碱基组成的寡核苷酸片段,它具有类似抗体的高特异性结合靶标分子的功能,且识别目标分子范围更广、更易于合成、稳定性更佳等优势,目前已得到广泛研究应用[9-10]。本实验所采用的OTA适配体序列于2008年被Penner和Cruz-Aguado经指数富集系统进化的体外筛选技术(SELEX)成功筛选得出,多个实验证实其对OTA具有高度特异性结合能力[11-13]。而CNNS是近年来发展起来的纳米层状材料,由石墨型氮化碳经过超声剥离制得[14],该材料拥有类石墨烯的理化性质,对单链DNA可通过强的π-π堆积作用将其吸附至表面,而对双链DNA和其他DNA-分子复合物的吸附能力则大为下降[15]。也正基于此,在本实验中,CNNS很容易将处于游离状态的OTA适配体吸附到其表面,并通过光诱导电子转移的模式[15]淬灭标记在适配体一端的荧光素基团。而当溶液中含有OTA时,该适配体与其靶分子OTA结合形成复合物,此时CNNS对该复合物的吸附能力大为下降,溶液的荧光信号得到恢复,且这种信号的变化情况与OTA的含量之间存在正相关。以上是本方法用于检测OTA的基本原理。
从检测灵敏度上看,该方法检测限低至0.7 nM,具有较高的检测灵敏度。这是因为该检测模式为信号增强型,没有目标物存在时整个体系的背景信号非常低,该情况下,目标分子引起的信号变化较信号抑制型(即初始信号100%,加入目标物后引起信号降低)的方法更为敏感。
从选择性上看,真菌毒素的另外两种主要成分OTB和AFB1在较高浓度下对OTA检测的影响仍然十分有限,实验表明该检测方法对OTA的识别具有高选择性,这一结果主要是由OTA适配体对其靶分子的高选择性结合能力决定的。OTA适配体可以很容易地与低浓度的OTA结合形成复合物,但是与OTB和AFB1的结合能力相对弱化很多。当这两种毒素存在时,该适配体仍主要以游离态存在而被吸附至CNNS表面,使溶液荧光处于低信号强度状态,正因如此,该方法具有高度的检测选择性。
中药材在生产、运输和和存贮过程中容易发生霉变而产生OTA,本方法具有高度的检测选择性和良好的检测灵敏度,有望用于对药材复杂基质中的OTA的检测。