小肠黏膜下层与内皮细胞复合构建组织工程血管

王飞

（邯郸市中心医院关节外科, 邯郸, 056001）

目前，全世界每年约有20 万例周围血管移植手术，自体血管移植是目前最为理想的血管替代物，但自体血管材料来源有限，且血管内径的匹配在移植方面也受限制[1]。随后有学者提出采用同种异体血管及组织工程血管来代替自体血管，但同种异体血管移植后会出现渐进性的血管变性及增生异常，导致血管狭窄或闭塞从而使移植失败[2]。因此，人们把研究方向放在组织工程血管上。

小肠黏膜下层（small intestinal submucosa, SIS）是一种天然的细胞外基质，可通过机械方法除去小肠肌层和黏膜层，从而获得一种半透明的胶原基质，处理后的SIS 主要由Ⅰ和Ⅲ型胶原蛋白构成，并含少量Ⅳ、Ⅴ型胶原蛋白，是一种不含细胞的基质材料，由于其具有较好的生物相容性、无免疫原性、可促进组织再生、在体降解速度快和机械强度高等特性，在组织工程材料方面受到广泛关注[3]。本实验主要目的是应用SIS 构建组织工程血管支架，并对其复合内皮细胞进行分析，从而为制备组织工程血管提供前期准备。

材料与方法

1 实验材料

本实验于2016 年04 月至2017 年04 月在河北省邯郸市中心医院中心实验室完成。实验动物选择当地屠宰场选取5 ～6 月龄家猪，取新鲜空肠作为制备SIS 材料，无菌条件取下肢大隐静脉备用。

2 主要试剂

乙二胺四乙酸、氢氧化钠、盐酸、过氧乙酸和乙醇购自北京化学试剂有限公司；磷酸缓冲盐溶液和Hoechst33258 购自Solarbio 公司；FDA/PI 购自美国Sigma 公司；鼠来源层粘连蛋白（laminin）抗体和兔来源纤维连接蛋白（fibronectin）抗体购自英国Abcam 公司；山羊抗小鼠IgG/Alexa ®488 和山羊抗兔IgG/TRITC 购自中山金桥生物技术有限公司；DMEM 细胞培养基购自康宁公司；100×青霉素/链霉素双抗溶液购自美国Hyclone 公司；胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物工程有限公司。

3 小肠黏膜下层的制备及去抗原性

用生理盐水反复冲洗新鲜猪空肠后用无菌带齿镊撕下空肠外面的浆膜层、肌层，然后翻转空肠，撕下内侧的黏膜层，剩下的组织即为SIS。

将制备好的SIS 膜放入乙二胺四乙酸（100mmol/L）和氢氧化钠（10mmol/L）的混合溶液中浸润16h，取出后无菌蒸馏水反复冲洗，随后放入盐酸（1mmol/L）和氯化钠（1mmol/L）的混合溶液中浸润8h，取出后无菌蒸馏水再次反复冲洗。放入PBS 中浸润16h，再次用无菌蒸馏水反复冲洗。随后放入过氧乙酸（0.1%）和乙醇（20%）的混合溶液中浸润8h，用含0.05%三氮化钠的磷酸缓冲盐溶液反复冲洗。将制备好的SIS 冷冻干燥后150Gyγ射线辐照消毒备用。

4 层粘连蛋白和纤维连接蛋白免疫荧光染色

将制备成功的SIS 冰冻切片，丙酮固定后PBS液体洗3 次，3%过氧化氢中避光20min，再次PBS洗3 次后取鼠来源Laminin 抗体和兔来源Fibronectin 抗体各1µl 加入198μl PBS 液中，4℃条件下过夜，随后加入山羊抗小鼠IgG/Alexa ®488 和山羊抗兔IgG/TRITC，避光孵育2h，荧光显微镜下观察并记录。

5 大隐静脉血管内皮细胞分离培养与扩增

无菌条件下切取新鲜猪大隐静脉，将其浸入含肝素的生理盐水中反复冲洗静脉内残留的血液，随后用含低分子肝素钠生理盐水再次反复冲洗，直至流出液体清亮为止。用5ml 注射器将约5ml 的0.1%Ⅱ型胶原酶自静脉的一端注入，管腔充盈后用止血钳夹住血管两端，消化30min，随后用含5%胎牛血清的DMEM 培养液反复冲洗数次，以终止消化，并将冲洗液和消化液一同收集入离心管中，以1500r/min 离心3min，弃上清液，再次用含5%胎牛血清DMEM 培养液冲洗、离心、弃上清液。用含10%胎牛血清、1mg/L 碱性成纤维细胞生长因子、1mg/L 血管内皮细胞生长因子的DMEM/F12 培养液冲洗后植入培养瓶中，加入双抗(青霉素及链霉素)10μl。于培养箱（37℃、5% CO2）中培养。倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，细胞贴壁后换液，待细胞生长达80%～90%时进行传代培养。

6 细胞接种及复合培养

小肠黏膜下层于培养液中浸泡20min 后平铺于6 孔板中，取第3 代生长状态良好的内皮细胞，弃培养液，PBS 液体洗3 次后加入0.25%胰蛋白酶消化，收集细胞并计数后以1×105/cm2的密度接种于小肠黏膜下层材料表面，成功构建小肠黏膜下层与内皮细胞复合体，加入适量含10%胎牛血清DMEM/F12培养液，置于培养箱（37℃、5% CO2）中培养24h。

7 Hoechst33258 染色

将25μg/mL 的Hoechst33258 分别加入至无细胞接种的SIS 和细胞接种后的SIS 表面，，常温孵育5min，丙三醇处理后荧光显微镜观察并记录。

8 FDA/PI 染色观察

将六孔板中培养液吸出，向每孔中加入FDA（15μg/mL）80μl 侵染5min，PBS 漂洗，再加入PI（15μg/mL）80μl 侵染5min，PBS 再次漂洗，荧光显微镜观察并记录。

结 果

1 体外培养的大隐静脉血管内皮细胞生长状态良好

倒置相差显微镜下观察，第三代贴壁生长的大隐静脉血管内皮细胞多呈小三角形，互相镶嵌排列，细胞融合达80%左右，生长状态良好（图1）。

图1 体外培养大隐静脉血管内皮细胞的形态正常。比例尺，100μmFig. 1 The morphology of vascular endothelial cells isolated from porcine greatporcine great saphenous vein and cultured in vitro was normal. Scale bar,100μm

2 小肠黏膜下层中的层黏连蛋白及纤维连接蛋白表达丰富

免疫荧光染色结果显示，SIS 中含有较高水平的层黏连蛋白（图2A）及纤维连接蛋白（图2B）表达。

图2 小肠黏膜下层中的层黏连蛋白(A)及纤维连接蛋白(B)的表达丰富。比例尺，5000μmFig. 2 High expression of laminin (A) and fibronectin (B) in SIS . Scale bar, 5000μm

3 Hoechst33258 染色显示内皮细胞种植于小肠黏膜下层后的存活数量大

Hoechst33258 染色结果显示，接种前的SIS 未见明显细胞核着色，只有深蓝色背景（图3A），而在体外培养的大隐静脉血管内皮细胞接种于SIS 之后，在深蓝色背景上可见数量较多的呈亮蓝色的细胞核（图3B）。

4 FDA/PI 荧光染色显示种植于小肠黏膜下层支架上的内皮细胞生长状态良好

FDA/PI 荧光染色结果显示，在SIS 材料上可见大量呈绿色荧光的活细胞，以及少量呈红色荧光的死细胞，它们均匀分布，表明内皮细胞于SIS 支架上生长状态良好（图4）。

讨 论

以自体血管移植手术这种以创伤修复创伤的办法加重了患者的痛苦与损伤[4]，且由于自体静脉与动脉在结构上存在差异，长度、内径匹配的自体血管有限，以及静脉本身病变率较高等缺点，严重限制自体血管的临床应用[1]。

图3 小肠黏膜下层接种内皮细胞前后的生长状态比较。A.内皮细胞种植前无活细胞；B.内皮细胞种植后可见大量存活细胞。比例尺，200μmFig. 3 The observation of the growth state of SIS before and after endothelial cells inoculation. A. no viable cells before endothelial cell inoculation; B.a large number of surviving cells after endothelial cell inoculation; scale bar, 200μm

图4 小肠黏膜下层支架上内皮细胞生长状态良好。比例尺，200μmFig. 4 The good growth state of endothelial cells on SIS stent. Scale bar, 200μm

小肠黏膜下层为一种天然无免疫原性的细胞外基质材料，并且含有多种细胞生长因子，如血管生长因子（VEGF）、上皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子-2(FGF-2)、颗粒酶B、转化细胞生长因子 β、硫酸蛋白多糖、肝细胞生长因子、层粘连蛋白和纤维连接蛋白等[5]，已被广泛应用于异基因组织工程支架的构建。FGF-2 可刺激血管内皮细胞、平滑肌细胞增殖与迁移，创造血管再生的条件[6]。Hang 等人研究表明SIS 可诱导血管内皮细胞形成管状结构，其作用与应用VEGF 相似，从而间接表明SIS 中含有VEGF[7]。Hendel 等人研究表明SIS 中的颗粒酶B 可释放血管内皮生长因子并诱导血管通透性[8]。通过机械方法制备的SIS 具有三维立体结构，孔隙率约60%，可促进细胞黏附和增殖，其具有的机械强度可有力支撑新生组织[9]。SIS 在皮肤[10]、骨膜[11]、神经[9]、膀胱[12,13]、声带[14]等组织工程构建中已显示出较好的生物相容性，机械强度高，无免疫原性，抗微生物活性，以及部位特异的组织再生能力等特性，满足了组织工程血管的基本要求，在血管组织工程支架材料研究中日益受到重视。

我们使用机械法制备猪空肠的SIS，随后去除SIS 上的残留细胞，使其成为具有三维立体结构的天然细胞外基质。相关研究表明，SIS 经过制备处理后仍含有前述的多种细胞生长因子[15]。我们也证明SIS 上含有丰富的层粘连蛋白和纤维连接蛋白，纤维连接蛋白含有精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸序列，可以特异性结合细胞膜受体，从而促进细胞粘附；层粘连蛋白也具有促进细胞粘附的作用。内皮细胞接种于SIS 上后，细胞存活数量较多，分布比较均匀，内皮细胞生长状态良好，这得益于SIS 上含有较多的层粘连蛋白和纤维连接蛋白，从而也说明了SIS 对于内皮细胞具有较好的生物相容性。

通过研究SIS 体外拟生态环境下与内皮细胞复合培养以探索构建组织工程血管临床应用的可行性，本实验表明内皮细胞和SIS 复合培养后的生长状态良好，具有较好的生物相容性，同时相关研究也表明SIS 可诱导血管内皮细胞形成管状结构[3]，故SIS 具有构建组织工程血管的能力，可行性较高。另外，猪SIS 基质制备方便，价格低廉，来源稳定，为理想的组织工程血管材料。