Rspo1、LGR5、NF-κB/p65 在胃癌中的表达及其临床意义

王骞，谭林，陈维顺

（中南大学湘雅医学院附属株洲医院消化内科，株洲 412000）

目前中国每年胃癌发病率及死亡率分别居于第2、3 位[1]，然而我国胃癌的早期诊断率不足10%，通过探索各类细胞信号通路研究胃癌的发病机制及寻找可靠的胃癌相关分子标志物是当前研究的热点。Wnt/β-catenin 与NF-κB 通路是两条在进化中高度保守的信号通路，两条信号通路之间可通过独立及互相串联来调节细胞存亡、增殖及分化等。Wnt/β-catenin 与NF-κB 的异常活化均与胃癌的发生有关[2,3]。特异性顶部盘状底板反应蛋白家族（Rspos）是新近发现的Wnt 信号通路激活剂，其家族成员Rspo1 与富含亮氨酸的重复G 蛋白偶联受体5（LGR5）结合后可激活Wnt/β-catenin通路[4]，已有研究发现Rspos-LGR5-Wnt/β-catenin 这一信号传导途径对正常胃上皮细胞的增殖更新以及促进细胞癌变及肿瘤侵袭、转移等方面有着重要作用[5-7]。核转录因子κB（NFκB）是一种核转录调节因子，以p65/p50 二聚体为中心的经典NF-κB 通路的异常活化可促进肿瘤细胞增殖、侵袭及转移[8]。近来研究[9]发现，Wnt/β-catenin与NF-κB 通路之间存在多种互相调控而活化的机制，从而形成复杂的共刺激信号网络。本研究通过检测Rspo1、LGR5 与NF-κB/p65 在胃癌组织中的表达，分析三者与胃癌临床病理及患者预后之间的关系，并初步探讨Rspo1-LGR5 这一新Wnt 激活途径与经典NF-κB 通路之间的可能相关性。

材料与方法

1 标本收集

收集中南大学湘雅医学院附属株洲医院2014年8月至2016年5月普外科胃癌根治手术切除标本115例，癌旁正常胃组织标本20 例（均距癌缘＞10cm，病理证实无癌浸润）。患者术前均未接受放、化疗，所有标本均经术后病理证实。其中男性82 例，女性33 例，年龄35～89 岁（平均年龄61 岁）。胃癌组织根据国际抗癌联盟（UICC）第7 版标准进行临床TMN 分期，浸润深度按照UICC 标准中的T 分期标准确定，依据病理标准确认分化程度。所有标本经4%多聚甲醛固定后，脱水、透明、浸蜡包埋，制成4μm 厚连续切片。

2 试剂

兔抗人Rspo1 多克隆抗体（稀释比1∶400）、兔抗人LGR5 多克隆抗体（稀释比1∶100）、兔抗人NFκB/p65 多克隆抗体（稀释比1∶800）购自英国Abcam公司。二甲苯、无水酒精、石蜡、PBS 缓冲液、枸橼酸钠缓冲液购自广州瑞斯生物技术有限公司。SP试剂盒、DAB 显色剂、中性树胶封片剂购自北京中山金桥生物技术有限公司。

3 免疫组化染色及结果判断

常规脱蜡、水化，枸橼酸高压修复，H2O2封闭内源性过氧化物酶活性，正常山羊血清封闭，滴加一抗，孵育过夜。DAB 显色，苏木素复染，中性树胶封片，显微镜镜检及图像采集分析。结果判断：由病理科医师双盲阅片，以胞质/胞核中出现黄色或黄褐色颗粒视为免疫组织化学染色阳性。免疫组化计分包括染色强度及阳性细胞比例确定。按染色强度分级：无染色或与背景一致的浅黄色为0 分，黄色记1分，棕黄色记2 分，黄褐色记3 分。按阳性细胞比例分级：每片随机观察5 个高倍镜视野（200×），计算染色阳性细胞所占比例：阳性细胞数＜5%计0分，5%～25%计1 分，26%～50%计2 分，＞50%计3 分。每张切片得分由染色强度评分与阳性细胞比例评分相加所得，0～3 分判定为阴性表达，4～6 分判定为阳性表达。

4 随访

通过电话及门诊对患者进行随访，所有患者均随访至2019 年5 月或至患者死亡，共获得随访资料115 例，失访0 例。

5 统计学处理

采用SPSS 25.0 进行统计学分析。率的比较采用χ2检验或校正χ2检验；相关性分析采用Spearman相关性分析；生存分析采用Kaplan-Meier 法，Log-Rank检验；单因素和多因素COX回归比例模型分析胃癌患者的预后影响因素。取α=0.05 为检验水准，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

结 果

1 Rspo1、LGR5、NF-κB/p65 在胃癌组织表达率增高

Rspo1、NF-κB/p65 主要表达于胞质和胞核，LGR5 主要表达于胞质，部分表达于胞核。在20 例癌旁正常组织中Rspo1、LGR5、NF-κB/p65 阳性表达率分别为25%、35%、35%（图1）；在115 例胃癌组织中Rspo1、LGR5、NF-κB/p65 阳性表达率分别为54.8%、62.6%、60%（图1），显著高于正常组织（表1）。Rspo1 与LGR5 在胃癌组织中的表达位置基本一致（图2）。

图1 Rspo1、LGR5 和NF-κB/p65 在胃癌组织及正常组织中表达的免疫组织化学检测。比例尺，50μmFig. 1 Immunohistochemical examination for expressions of Rspo1, LGR and NF-κB/p65 in the gastric carcinoma tissues and normal gastric tissues.Scale bar, 50μm

表1 Rspo1、LGR5 和NF-κB/p65 在胃癌组织及正常组织中的表达Tab. 1 Expressions of Rspo1, LGR5 and NF-κB/p65 in gastric carcinoma tissues and normal gastric tissues

2 Rspo1、LGR5 表达与临床病理参数的关系

在胃癌患者中，Rspo1、LGR5、NF-κB/p65 的表达与TNM 分期、浸润深度、淋巴结及远处转移有关，另外，Rspo1 与肿瘤大小，LGR5 与肿瘤大小及分化程度同样有关；Rspo1 的表达与患者性别、年龄、肿瘤分化程度，LGR5 的表达与患者性别、年龄，以及NF-κB/p65 的表达与患者性别、年龄、肿瘤大小及分化程度之间无明显相关性（表2）。

3 Rspo1、LGR5、NF-κB/p65 在胃癌组织中表达的相关性分析

LGR5 在Rspo1 阳性组中的表达率为77.8%（49/63），在Rspo1 阴性组中的表达率为44.2%（23/52），显著低于Rspo1 阳性组（χ2=13.695，P＜0.001）；NF-κB/p65 在Rspo1 阳性组中的表达率为74.6%（47/63），在Rspo1 阴性组中的表达率为42.3%（22/52），显著低于Rspo1 阳性组（χ2=12.380，P＜0.001）；NF-κB/p65 在LGR5 阳性组中的表达率为65.3%（47/72），在LGR5 阴性组中的表达率为51.2%（22/43），两者差异无统计学意义（χ2=2.235，P=0.135）。

根据Spearman相关性分析，在胃癌组织中，Rspo1 与LGR5 的表达存在正相关，Rspo1 与NFκB/p65 的表达存在正相关，LGR5 与NF-κB/p65 的表达无明显相关性（表3）。

4 Rspo1、LGR5、NF-κB/p65 表达与胃癌患者3 年生存率的关系分析

Kaplan-Meier 分析显示，在胃癌患者中，Rspo1表达阳性组3 年生存率低于表达阴性组（χ2=10.656，P=0.001，图3A）；LGR5 表达阳性组3 年生存率低于表达阴性组（χ2=12.439，P＜0.001，图3B）；NF-κB/p65 表达阳性组3 年生存率低于表达阴性组（χ2=6.430，P=0.011，图3C）。

5 胃癌患者预后Cox 回归分析

单因素Cox 回归分析显示，肿瘤大小、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、Rspo1、LGR5 及NF-κB/p65 表达阳性可能是影响胃癌患者预后的危险因素；多因素Cox 分析显示，淋巴结转移、远处转移、Rspo1 表达阳性及LGR5 表达阳性可能是影响胃癌患者预后的独立危险因素（表4）。

图2 Rspo1 与LGR5 在胃癌组织中表达部位比较。A，Rspo1; B，LGR5; scale bar, 50μm；比例尺，50μmFig. 2 Comparison for expression sites of Rspo1 and LGR5 in gastric carcinoma tissues. A, Rspo1; B, LGR5; scale bar, 50μm

讨 论

Rspos 蛋白家族是一组由4 种典型的人类分泌型蛋白（Rspo1-4）组成的新型分泌型蛋白家族，参与体内外Wnt/β-catenin 信号通路的放大[10]，其主要生理功能包括参与性别决定，调节肢体、内脏器官发生、发育[11]。LGR5 是Rspos 的受体及Wnt/β-catenin通路的靶基因之一，是胃肠道、乳腺、卵巢等多种细胞的干细胞标志物[12]，也是胃癌、结直肠癌、肝癌等恶性肿瘤的干细胞标志物[13-16]。近年来研究发现[4]，LGR5 与Rspo1 结合后消除Wnt 拮抗剂ZNRF3/RNF43 的泛素化作用而激活Wnt/β-catenin 通路。Zhang 等[6]发现在胃癌细胞系中Rspo2 与LGR5的表达均明显高于正常细胞，Rspo2还与胃癌细胞的上皮间充质转化（EMT）有关。Shamai 等[7]则发现胃癌细胞可诱导间充质干细胞表达Rspos 及LGR5以维持肿瘤细胞的增殖、生长。本研究发现Rspo1及LGR5 在胃癌中的表达高于癌旁正常组织，其表达水平与肿瘤大小、浸润深度、TNM 分期、淋巴结及远处转移密切相关，并且免疫组化染色显示二者在胃癌组织的表达位置基本一致，相关性分析也证实Rspo1 表达与LGR5 表达之间存在正相关，提示二者具有协同作用，并且其促癌作用是很可能是通过Rspo1-Wnt/β-catenin-LGR5 这一信号通路实现的。而生存分析显示Rspo1 阳性表达及LGR5 阳性表达患者3 年生存率均低于表达阴性患者，同时Cox 回归分析也显示Rspo1 与LGR5 表达阳性是影响胃癌患者预后的独立危险因素。我们推测Rspo1 与LGR5通过活化经典Wnt/β-catenin 信号通路而导致了胃癌的侵袭、转移及不良预后。

表2 . Rspo1、LGR5、NF-κB/p65 在胃癌中表达与临床病理参数的关系Tab. 2 Relationship between the expressions of Rspo1, LGR5, NF-κB/p65 and the clinicopathological factors of gastric carcinoma

表3 Rspo1、LGR5、NF-κB/p65 在胃癌组织中表达的Spearman 相关性分析Tab. 3 Spearman correlation analysis for the expressions of Rspo1, LGR5, NF-κB/p65 in gastric carcinoma

NF-κB 是调节免疫、炎症等反应的重要转录因子，NF-κB/p65 是经典NF-κB 通路的中心成员，而经典NF-κB 的异常活化已被发现在胃癌的发生及侵袭、转移中起到了重要作用[3,17]。大量研究证实NFκB与Wnt/β-catenin通路之间存在多种不同方式的互相影响共同促进恶性肿瘤的发生[9]。Schwitalla 等[18]研究显示Wnt/β-catenin 与NF-κB/p65 通路相互活化促进胃肠道细胞向腺瘤及腺癌转化。有研究[19]发现幽门螺杆菌感染可激活巨噬细胞诱导产生TNF-α，并通过NF-κB 通路增强胃癌细胞中Wnt/β-catenin 信号传导而加强其侵袭性。在乳腺癌、肺癌、结直肠癌[20-22]等恶性肿瘤中也发现了Wnt/β-catenin 与NFκB通路之间的相互作用及共激活而促进肿瘤发生、发展的现象。本次研究发现NF-κB/p65 在胃癌组织中高表达，TNM 分期晚，浸润深，有淋巴结与远处转移的病例，NF-κB/p65 表达阳性率更高，与相关报道一致[23]，提示NF-κB 通路的活化在胃癌的发生发展中起到重要作用。相关性分析表明，NF-κB/p65在Rspo1 阳性组中表达率高于Rspo1 阴性组的表达率，NF-κB/p65 的表达还与Rspo1 表达呈显著正相关，提示Rspo1 在激活经典Wnt/β-catenin 信号通路同时还可能激活了NF-κB 通路，这两条信号通路共同影响肿瘤细胞的增殖、侵袭过程。

综上所述，本研究中我们发现Rspo1、LGR5 及NF-κB/p65在胃癌组织中高表达，表达水平与胃癌的发展程度相关，提示三者与肿瘤的发生、侵袭、转移有关。Rspo1 与LGR5 与患者预后有关，二者可能是影响胃癌患者预后的独立危险因素，检测Rspo1、LGR5 的表达可能成为未来协助诊断、判断预后的潜在分子标志物，也可能成为靶向治疗胃癌的新靶点。而在相关性分析中发现NF-κB/p65 在Rspo1 阳性组的表达明显高于Rspo1 阴性组，并且NF-κB/p65的表达与Rspo1 明显正相关，提示Rspo1-LGR5 这一新Wnt 激活通路同时还活化了NF-κB 通路，进一步完善了Wnt/β-catenin 与NF-κB 通路之间的调控网络，同时为以后的相关研究提供了新的思路。然而由于本研究仅为临床研究，Rspo1-LGR5 在胃癌中调节Wnt/β-catenin 通路的具体机制以及Rspo1- Wnt/βcatenin-LGR5 与NF-κB 通路的具体联系与调控机理并不清楚，后续还需通过体外细胞和动物体内研究等多个层面深入阐述其调节机制，并为进一步的胃癌诊断和治疗提供理论依据。

表4 胃癌患者预后与病理因素的Cox 回归分析Tab. 4 Cox regression analysis of prognosis and clinicopathological factors in gastric carcinoma patients