HPV16E7 的表达对宫颈癌变过程中CD163+巨噬细胞的浸润及上皮间质转化的影响

尚立娜，安利峰，张城，龚川友，周彰映，田世馨，李晓琴，赵晋*

（1 西北民族大学医学院，2 甘肃省肿瘤医院病理科， 兰州 730030）

宫颈癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤之一，死亡率居恶性肿瘤的第四位。在宫颈癌的组织学类型中最常见的为鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma, SCC），占所有病例的85%～90%。研究发现，高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）癌基因E6、E7 的持续表达是宫颈上皮细胞发生恶性转化及持续进展为浸润性宫颈癌的必要条件[1]，其中E7 可以通过从E2F 复合物中螯合Rb 来阻止、破坏一系列信号通路，从而促进肿瘤生长，侵袭或转移[2]。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是上皮细胞转化为间质细胞的暂时性和可逆性的生物学过程，具体表现为上皮细胞发生成纤维细胞样的形态改变，细胞粘附降低，细胞活力、运动性增加[3]。研究表明，EMT 在促进原发肿瘤的侵袭和转移中起着关键的作用[4]，上皮细胞的侵袭性取决于EMT 的激活。肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages, TAMs）是泛指在肿瘤发生过程中浸润于肿瘤并影响其发展转归的巨噬细胞，具有M2 型巨噬细胞的表型并表达CD68 和CD163[5]。研究发现，高密度的TAMs 与预后不良相关，并影响各种实体肿瘤的发生、发展和转移[6,7]。但是在宫颈癌变中HPV16E7 的表达与EMT 及TAMs之间到底有什么样的联系，还未见报道。本研究通过免疫组织化学检测宫颈鳞状细胞癌（SCC）、高级别上皮内瘤变（CINII-III）、低级别上皮内瘤变（CINI）及慢性宫颈炎中HPV16E7 蛋白的表达，上皮间质转化标记E-cadherin、N-cadherin 的表达以及肿瘤相关巨噬细胞标记CD163 的表达情况，来探讨不同HPV16E7 的表达状态下，EMT 与TAMs 之间的关系。

资料与方法

1 标本来源

收集甘肃省肿瘤医院病理科2014 ～2018 年石蜡包埋标本共233 例。其中，宫颈鳞状细胞癌98 例，包括角化型鳞状细胞癌51 例，非角化型鳞状细胞癌47 例，患者年龄25～67 岁，中位年龄48 岁；CINIIIII 52 例；CINI 54 例；另外选取因子宫肌瘤行全子宫切除术，术后病理证实为慢性宫颈炎的宫颈标本29 例。以上病例的收集排除宫颈癌根治性手术前后接受过放射治疗与化疗等非手术治疗的患者。所有患者知情同意， 经医院伦理委员会批准。

2 主要试剂及方法

所有标本经10%甲醛常规固定，石蜡包埋，4μm厚切片，常规HE 及免疫组织化学染色，MaxVision法详细步骤严格按照说明书进行。鼠抗人单克隆抗体CD68（MAB-0041，1∶100）， 鼠抗人单克隆抗体CD163（MAB-0206，1∶100）， 鼠抗人单克隆抗体E-cadherin（MAB-0589，1∶100），鼠抗人单克隆抗体N-cadherin（MAB-0571，即用型）及免疫组织化学MAXVisionTM2试剂盒（KIT-5920）购自福州迈新公司，HPV16E7 鼠抗人单克隆抗体（289-17013，1∶1000）购自GeneTex 公司。

3 结果判定

免疫组织化学结果由两位有经验的病理科医师采用双盲法独立阅片后做出判断。HPV16E7 以细胞核呈黄色或黄褐色颗粒为阳性细胞，E-cadherin 以细胞膜、N-cadherin 以细胞质呈黄色或黄褐色颗粒为阳性细胞。光学显微镜下随机选取5 个高倍镜视野，每个视野记数100个细胞，计算阳性细胞数占总细胞数的百分比，取5 个视野的算术平均值。①根据显色细胞的比例计分：0 分（显色癌细胞为0%）；1 分（显色细胞＜10%）；2 分（显色细胞10%～25%）；3 分（显色细胞25%～50%）；4 分（显色细胞＞50%）。②根据细胞染色强度计分：0 分（癌细胞无显色）；1 分（浅黄色)；2 分（棕黄色或黄褐色)。两种计分方法相乘，作为最终免疫组化判定结果。其中，E-cadherin 及N-cadherin 的染色结果判断：0 分为阴性（-），1～2 分为弱阳性（+），3～5 分为中等阳性（++），6～8 分为强阳性（+++），1～8 分计为表达阳性，0 分计为表达阴性；HPV16E7 的染色结果判断：0～1 分计为表达阴性，2～8 分计为表达阳性。TAMs 的分布和计数： 用 CD163 标记TAMs。以细胞膜、细胞质被染为棕黄色的细胞为CD163+巨噬细胞，在光镜下观察其一般形态及分布后，对CD163+巨噬细胞的数量进行计数，首先在10 倍物镜下找到视野中CD163+巨噬细胞在肿瘤中密度最高的五个区域，即热点区域，然后在400 倍物镜下对CD163+巨噬细胞进行计数，取平均值进行统计学分析。

4 统计学分析

采用 SPSS18. 0 进行统计分析，计量资料用¯χ±s表示，各分类变量的相关关系均采用Spearman 等级相关分析，组内及组间频率比较采用秩和检验，两样本均数比较采用两独立样本t检验，P＜0. 05 为差异具有统计学意义。

结 果

1 HPV16E7 在慢性宫颈炎、CINI、CINII-III 及宫颈鳞状细胞癌中表达增强

HPV16E7蛋白的表达主要定位在细胞核，本研究结果显示，HPV16E7蛋白在慢性宫颈炎、CINI、CINIICINIII 及宫颈癌中表达率逐渐升高（图1，表1）。

表1 E-cadherin 和N-cadherin 在宫颈癌变中表达水平比较Tab. 1 Comparison for expression levels of E-cadherin and N-cadherin in the cervical neoplasma generation

2 E-cadherin 在慢性宫颈炎、CINI、CINII-III 及宫颈鳞状细胞癌中的表达情况及与HPV16E7 的关系

E-cadherin 的表达主要定位在细胞膜。在慢性宫颈炎、CINI、CINII-CINIII 及宫颈癌中E-cadherin表达逐渐降低（r=-0.154，P=0.018）（图1）。HPV16E7 阳性的CINII-III 及宫颈鳞状细胞癌标本中E-cadherin 的表达明显低于HPV16E7 阴性标本（P=0.047，P=0.002），而CINI 及慢性宫颈炎组差异没有有统计学意义（P＞0.05）（表1）。

3 N-cadherin 在慢性宫颈炎、CINI、CINII-III 及宫颈鳞状细胞癌中的表达情况及与HPV16E7 的关系

N-cadherin 的表达主要定位在细胞质，且更倾向于分布在癌巢的最外围，形态呈长梭形(图1)。在慢性宫颈炎、CINI、CINII-CINIII 及宫颈癌中N-cadherin 随着宫颈癌变的进展表达逐渐升高（r=0.362，P=0.000）；宫颈鳞状细胞癌组内比较显示，HPV16E7阳性者N-cadherin 表达明显高于HPV16E7 阴性者（P=0.014）（表1）。

图1 宫颈癌变中HPV16E7、E-cadherin、N-cadherin 表达及CD163+巨噬细胞分布的MaxVision 法免疫组织化学检测。A，慢性宫颈炎中HPV16E7 蛋白呈阴性表达；E、I、M、Q，HPV16E7 蛋白在宫颈癌前病变及鳞状细胞癌中呈阳性表达；B、F、J、N、R，随着宫颈癌变的发生E-cadherin 的表达逐渐降低；C、G、K，N-cadherin 在宫颈癌前病变中呈阴性表达；O，在宫颈癌中，N-cadherin 表达趋向于分布在癌巢边缘的癌细胞，S, 上述宫颈癌中N-cadherin 阳性细胞的形态常呈长梭形；D、H、L、P、T，随宫颈癌变的发生CD163+巨噬细胞浸润逐渐增多。SCC：鳞状细胞癌；CINII-III：高级别上皮内瘤变；CINI：低级别上皮内瘤变。比例尺，100μmFig.1 Immunohistochemical examination (MaxVision method) for expression of HPV16E7, E-cadherin and N-cadherin and distribution of CD163+macrophages in the cervical neoplasma generation. A, negative expression of HPV16E7 protein in chronic cervicitis; E, I, M, Q, positive expression of HPV16E7 protein in cervical precancerous lesions and squamous cell carcinom; B, F, J, N, R∶ the expression of E-cadherin was significantly reduced with the cervical neoplasma generation; C, G, K, negative expression of N-cadherin in cervical precancerous lesions ; O, in cervical cancer, N-cadherin expression tended to be distributed in peripheral cells of the cancer nest; S, the morphology of N-cadherin-positive cells often exhibited a long spindle shape; D, H, L, P, T, CD163+ macrophages increased gradually with the cervical neoplasma generation; SCC, squamous cell carcinoma; CINII-III, highgrade intraepithelial neoplasia; CINI, low-grade intraepithelial neoplasia; scale bar, 100μm

4 CD163+巨噬细胞在慢性宫颈炎、CINI、CINIIIII 及宫颈鳞状细胞癌中的浸润情况及与HPV16E7的关系

CD163 主要定位在细胞膜及细胞质中，且更倾向于分布在癌巢浸润前沿的周围间质中。CD163+巨噬细胞数量随着宫颈癌变的发生逐渐升高（r=0.837，P=0.000）（图1）。在CINI、CINII-II、宫颈鳞状细胞癌组内，HPV16E7 阳性组细胞数量明显高于HPV16E7 阴性组，差异有统计学意义（P=0.021，P=0.000，P=0.000）（图2A）。

5 宫颈癌的癌变过程中不同HPV16E7 的表达情况下CD163+巨噬细胞的数目与E-cadherin 表达的关系

图2 不同宫颈病变组织中CD163+巨噬细胞数量及其在不同HPV16E7 表达状态下与E-cadherin 及N-cadherin 免疫反应性之间的关系。A，不同宫颈病变组织中CD163+巨噬细胞的计数情况；*，0.01＜P＜0.05；**，P＜0.01；SCC，鳞状细胞癌；CINII-III，上皮内高级别瘤变；CINI，上皮内低级别瘤变；NC，不考虑HPV16E7 的表达情况；B，宫颈癌变过程中，无论HPV16E7 的表达如何，CD163+巨噬细胞计数与E-cadherin 的表达均呈负相关关系；C，鳞状细胞癌中，HPV16E7+组CD163+巨噬细胞计数与E-cadherin 的表达呈正相关，而HPV16E7-组则无相关关系Fig. 2 The number of CD163+ macrophages in different cervical lesions and their relationship with immunoreactivity of E-cadherin and N-cadherin under different HPV16E7 expression status. A, number of CD163+ macrophages in different cervical lesions; *, 0.01＜P＜0.05; **, P＜0.01; SCC, squamous cell carcinoma; CINII-III, high-grade intraepithelial neoplasia; CINI, low-grade intraepithelial neoplasia; NC, HPV16E7 expression was not considered;B, during cervical carcinogenesis, CD163+ macrophages had a negative correlaton with expression of E-cadherin regardless of HPV16E7 status; C, in squamous cell carcinoma, the number of CD163+ macrophages in HPV16E7+ group was positively correlated with the expression of E-cadherin, but not correlated in HPV16E7- group

在慢性宫颈炎、CINI、CINII-III、宫颈鳞状细胞癌中，随着CD163+巨噬细胞数目的增多，E-cadherin的表达逐渐降低，二者呈负相关关系（r=-0.274，P=0.000）。HPV16E7 阳性组与HPV16E7 阴性组中CD163+巨噬细胞数目与E-cadherin 亦呈明显负相关关系（r=-0.180，P=0.045；r=-0.192，P=0.046）（图2B，表2）。

表2 宫颈癌变过程中CD163+巨噬细胞数目与E-cadherin 的相关关系Tab. 2 Correlation between the number of CD163+ macrophages and E-cadherin during cervical carcinogenesis

6 宫颈鳞状细胞癌中不同HPV16E7 表达情况下CD163+巨噬细胞的数目与N-cadherin 表达的关系

宫颈鳞状细胞癌中，随着CD163+巨噬细胞数目的增多，N-cadherin 的表达逐渐增加（r=0.531，P=0.000）。HPV16E7 阳性组中CD163+巨噬细胞数目与N-cadherin 的表达仍然呈正相关关系（r=0.587，P=0.000），而HPV16E7 阴性组二者无明显相关关系（r=0.252，P=0.122）（图2C，表3）。

表3 鳞状细胞癌中CD163+巨噬细胞数目与N-cadherin 的相关关系Tab. 3 Correlation between the number of CD163+ macrophages and N-cadherin in squamous cell carcinoma

讨 论

肿瘤EMT 表现为肿瘤细胞上皮特征的丧失如上皮细胞表型E-cadherin、β-cadherin 表达的减少以及间质细胞表型如N-cadherin、vimentin 表达的增加，在宫颈癌中亦存在这种现象[8]。许多研究者将EMT 过程中E-cadherin 的丧失和N-cadherin 表达的增加称为“cadherin switch”，而“cadherin switch”被认为是EMT 的主要标志[9,10]。然而，Abdallah 等[11]最近通过对前列腺癌的研究发现E-cadherin和N-cadherin之间没有负相关，推测“cadherin switch”不是EMT发展的必要步骤。本研究结果显示，E-cadherin 的表达随着宫颈癌变的进展表达逐渐降低，而N-cadherin的表达随着宫颈癌变的进展表达逐渐升高，这一结果符合“cadherin switch”的特征，提示“cadherin switch”可能在宫颈癌的癌变过程中具有重要作用。研究发现HPV16 癌基因及E6/E7 蛋白与宫颈癌进展和转移过程中的EMT 相关[12,13]，HPV16E7 可以和LSD1 形成复合物来促进EMT 的发生[14]。本研究发现，CINII-III 及宫颈鳞状细胞癌两组组内比较中，HPV16E7 阳性者其E-cadherin 的表达低于HPV16E7阴性患者。在宫颈鳞状细胞癌中，HPV16E7 阳性组的N-cadherin 表达明显高于HPV16E7 阴性组，这提示在宫颈癌中，HPV16E7 蛋白的表达可能通过调节“cadherin switch”来促进EMT，癌前病变中HPV16E7 蛋白也参与EMT 的发生。

肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在肿瘤发生、发展、侵袭和转移过程中发挥重要作用。在宫颈中，随着癌变程度升高TAMs 数量随之升高[15]。本研究发现在慢性宫颈炎、CINI、CINII-III 及宫颈鳞状细胞癌中，CD163+巨噬细胞数目逐渐增多，这与Hammes LS等[15]的研究结果相符。Swangphon P等[16]发现TAMs的浸润与高危HPV E6/E7 mRNA 表达之间明显相关，并与宫颈病变严重程度相对应。Chen XJ 等[17]亦有类似报道。本研究结果显示，在CINI、CINIIIII 及宫颈鳞状细胞癌组内比较中，HPV16E7 阳性患者其CD163+巨噬细胞数目明显高于HPV16E7 阴性患者，由此提示HPV16E7 的表达可能促进了TAMs的浸润，与前述结果相符合。

研究发现，癌症募集和激活TAM 的能力在很大程度上取决于恶性细胞获得未分化的间充质表型的能力，而获得未分化间充质表型也是EMT 的一部分[18,19]。在胆管细胞癌[20]、三阴性乳腺癌[21]、肺癌[22]、口腔癌[23]、结肠癌[24,25]、肝细胞癌[26]中，TAMs 可以通过诱导EMT 的发生来促进肿瘤的侵袭、进展或转移。在宫颈癌变过程中情况又如何呢？本研究结果显示，宫颈癌变过程中，随着CD163+巨噬细胞数目的增多，E-cadherin 的表达逐渐降低，二者呈负相关关系，在宫颈鳞状细胞癌中，随着CD163+巨噬细胞数目的增多，N-cadherin 的表达逐渐增加，二者呈正相关关系。从这些结果我们初步推测TAMs 可能通过调节“cadherin switch”诱导EMT的发生。那么，HPV16E7 的表达是否影响了此过程呢？我们的研究结果显示不管HPV16E7 阳性或是阴性，CD163+巨噬细胞数目与E-cadherin 表达均呈负相关关系，HPV16E7阳性组中CD163+巨噬细胞数目与N-cadherin 的表达呈正相关关系，而HPV16E7阴性组二者无明显相关关系，提示HPV16E7 的表达可能并非是影响CD163+巨噬细胞相关的E-cadherin表达降低的直接因素。但HPV16E7 的表达可能参与了CD163+巨噬细胞相关的N-cadherin 表达增高的过程。所以我们推测，HPV16E7 蛋白促进EMT中N-cadherin 蛋白表达增加可能是通过诱导TAMs的浸润来完成的，而HPV16E7 蛋白促进EMT 中E-cadherin 蛋白表达的降低，其机制并没有TAMs 的参与，具体途径还有待进一步研究。