阿格列汀对2型糖尿病模型大鼠心肌纤维化的保护作用及其机制

张 毅，孟祥雯

（湖北科技学院医药研究院糖尿病心脑血管病变湖北省重点实验室，湖北 咸宁 437100）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）作为21世纪发展最迅速的慢性疾病之一，严重危害人类的身体健康。其主要是由胰岛素抵抗或胰岛素分泌不足或两者共同作用而导致血糖持续升高［1］。根据国际糖尿病联合会的数据，到2035年，全世界DM患者的数量将从2013年的3.82亿增加到5.92亿［2］。DM心肌纤维化（DM myocardial fibrosis，DMMF）作为糖尿病心肌病（diabetic cardio myopathy，DCM）最主要的并发症，是各种心血管疾病的共同病理特征，主要表现为成纤维细胞的过度增殖和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的沉积，被认为是DCM的最初改变。在心肌纤维化过程中，胶原扮演着重要角色。正常生理条件下，胶原的产生和降解处于动态平衡状态，而高糖、高脂等病理因素可刺激心肌成纤维细胞过度增殖，胶原过度积聚，导致间充质重塑和结构紊乱，损害心功能，而致心力衰竭［3］。

参与心肌纤维化发生发展的因子很多，其中最重要的因子之一是转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）。它主要通过诱导下游经典的Smad通路参与DMMF的发生发展。而相关研究表明，TGF-β1诱导的非经典信号通路如丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK），NF-κB都在心肌纤维化中发挥着重要作用［4-5］。

阿格列汀（alogliptin，Alog）属于二肽基肽酶4（dipeptidyl peptidase-4，DPP-4）抑制剂，是一类新型的口服降糖药物，被广泛应用于治疗2型DM（type 2 DM，DM2）。DPP-4抑制剂主要通过抑制胰高血糖素样肽1（glucagon-like peptidase-1，GLP-1）和葡萄糖依赖性促胰岛素分泌多肽（glucosedependent insulinotropic polypeptide，GIP）的降解，提高内源性GLP-1和GIP的水平，促进胰岛素的产生和释放，从而改善血糖水平［6］。

目前，世界范围内已上市多种DPP-4抑制剂，如Alog、西格列汀、利格列汀和维格列汀等。靶向DPP-4抑制剂越来越被认为是有前景的抗DM药物。而在控制血糖的同时，预防和降低心血管风险也显得尤为重要。相关研究表明，Alog能减轻DM大鼠肝及心肌纤维化程度，改善心功能［7-8］，然而其分子机制尚不清楚。因此，本研究采用高糖高脂联合链佐星（streptozocin，STZ）诱导建立DM2大鼠心肌纤维化模型，再给予Alog进行治疗，探讨Alog对DM2大鼠心肌纤维化的保护作用及可能的作用机制，为Alog在DMMF的临床治疗应用中提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂和主要仪器

雄性Sprague Dawley（SD）大鼠40只，体质量180～200 g，购自华中科技大学实验动物中心，动物合格证批号：SCXK（鄂）2010-0009。苯甲酸Alog片（武田药品工业株式会社大阪工厂）；STZ粉末和小鼠抗人TGF-β1单克隆抗体（SAB5300197）购自美国Sigma公司；兔抗人胶原Ⅰ型多克隆抗体（ab34710）和兔抗人胶原Ⅲ型多克隆抗体（ab6310）、兔抗人转化生长因子β受体Ⅱ（transforming growth factor-β receptorⅡ，TβRⅡ）多克隆抗体（ab186838）购自英国Abcam公司；兔抗人转化生长因子β活化激酶1（transforming growth factor activated kinase 1，TAK1）多克隆抗体（#4505）、兔抗人P38-MAPK多克隆抗体（#9212）、兔抗人c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）多克隆抗体（#9252）和小鼠抗人磷酸化c-Jun氨基末端激酶（p-JNK）单克隆抗体（#9255s）购自美国CST公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体（BL003A）购自biosharp公司，苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂（G1004）和Masson染色试剂（G1006）购自武汉塞维尔公司；苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）购自碧云天公司；RIPA裂解液（radio immunprecipitation assay lysis buffer，RIPA）和蛋白酶抑制剂（protease inhibitor cocktail）购自美国CST公司；二喹啉甲酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白浓度检测试剂盒购自美国Thermo Fisher公司；电化学发光（electro-chemiluminescence，ECL）显影液购自武汉爱博泰克公司。BX53-正置荧光显微镜（Olympus公司，日本）；LP-涡旋振荡仪（Thermo Scientific公司，美国）；AL104-电子分析天平（METTLER TOLEDO公司，瑞士）；Universal HoodⅡ-凝胶成像系统（Bio-Rad公司，美国），5424R-低温高速离心机（Eppendorf公司，德国）；Synergy2-酶标仪（BioTek公司，美国）；PowerPac Basic-垂直电泳仪（Bio-Rad公司，美国）。

1.2 2型糖尿病大鼠模型的制备

分别给予大鼠4周高糖（10%）和高脂（20%）的饮食，单次ip给予STZ 55 mg·kg-1制备DM2大鼠模型。正常对照组大鼠饲喂正常饲料，ip给予等量柠檬酸缓冲液。检测空腹血糖≥16.7 mmol·L-1即为DM2造模成功。将DM2大鼠随机分为4组：正常对照组（n=10）、Alog药物对照（Alog）组（n=10）、模型（DM2）组（n=10）和Alog治疗（DM2+Alog）组（n=10）。Alog（每天5 mg·kg-1）通过ig给药，正常对照组和DM2组给予等量生理盐水。自高糖高脂喂养起，16周后处死大鼠［9］，取各组心尖组织置于4%多聚甲醛中进行固定，用于HE和Masson染色及免疫组化分析，左心室组织于液氮中冷冻后置-80℃冰箱冷冻保存备用。

1.3 HE染色观察大鼠心肌组织病理变化

各组心肌组织固定后，进行脱水、石蜡包埋，然后切片。将组织切片于60℃烤箱烘干1 h，然后脱蜡至水，苏木素染液浸染5 min，蒸馏水洗，1%盐酸乙醇分化6 s，蒸馏水洗，0.6%氨水返蓝10 s，蒸馏水洗，伊红染液浸染5 min，蒸馏水洗，脱水透明后采用中性树胶封片。于光学显微镜下观察心肌组织病理变化并拍照。

1.4 Masson染色观察大鼠心肌组织胶原纤维沉积

各组心肌组织固定后，脱水，石蜡包埋。待蜡块充分凝固后切片，60℃烘干1 h后，脱蜡至水，进行Masson染色。

用配制好的铁苏木素染液浸染5 min，蒸馏水冲洗，酸性乙醇分化10 s，蒸馏水洗，蓝化液浸染3 min，蒸馏水洗，丽春红染液浸染5 min，弱酸1 min，磷钼酸1 min，苯胺蓝1 min，弱酸1 min，然后脱水透明，中性树胶封片。显微镜下观察心肌组织胶原纤维沉积部位为蓝色，正常心肌组织为红色。

1.5 免疫组化法检测大鼠心肌组织中胶原Ⅰ型和胶原Ⅲ型蛋白表达

各组大鼠心尖组织固定、脱水、石蜡包埋，然后切片，60℃烘干1 h后，脱蜡至水，加抗原修复液进行微波抗原修复后，PBS洗3次，每次5 min，用3%H2O2避光封闭25 min后，PBS洗3次，每次5 min，滴加3%BSA室温封闭30 min，沥干多余BSA液体，滴加1∶100比例稀释的一抗，于湿盒内4℃孵育过夜。PBS洗3次，每次5 min，滴加1∶100比例稀释的羊抗兔IgG室温孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min；滴加DAB染色液显色，镜下观察阳性细胞被染色后，水洗终止反应，然后将片子放入苏木素染液复染2～3 min，水洗1 min，1%盐酸乙醇分化5 s，水洗2 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明、风干后中性树胶封片。于普通光学显微镜下观察心肌组织中胶原蛋白表达，阳性区域呈深棕色。

1.6 Western印迹法检测大鼠心肌组织中相关蛋白表达

取各组心肌组织30 mg，分别加含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，于冰浴条件下匀浆，再置于冰上裂解30 min后，在4℃条件下以12 000×g离心10 min，取上清转移到新的EP管内，用BCA法测定蛋白浓度。然后将蛋白样品与上样缓冲液（3×）按2∶1体积比混合均匀后，95℃变性5 min。之后进行SDSPAGE蛋白电泳，在冰浴条件下250 mA，3 h转膜。转膜结束后，用TBST洗膜3次，然后用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，用1∶1000比例配制的一抗在4℃摇床上孵育过夜，TBST洗膜3次，用1∶10 000比例配制的二抗室温摇床上孵育1 h，TBST洗膜3次，采用ECL化学发光法显影，使用ImageJ软件进行半定量分析，以目的条带吸光度值与内参条带吸光度值的比值表示目的蛋白相对表达水平。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 Alog对2型糖尿病模型大鼠心肌组织病理变化的影响

HE染色结果显示，正常对照组大鼠心肌细胞形态完整、排列规则、整齐；DM2组大鼠心肌细胞肥大且排列紊乱、松散，心肌间充质出现炎性细胞浸润，成纤维细胞增殖；与DM2组大鼠比较，给与Alog治疗后的大鼠心肌细胞肥大有所改善，纤维排列趋于整齐（图1）。

2.2 Alog改善2型糖尿病模型大鼠心肌组织胶原的沉积

Masson染色结果显示（图2A和B），正常对照组大鼠心肌细胞间充质中胶原纤维较少且分布均匀；DM2组大鼠心肌细胞排列紊乱，胶原纤维明显增加且主要在血管周围沉积，为正常对照组的2.1倍（P＜0.05）；DM2+Alog组较DM2组心肌细胞排列趋于整齐，间充质纤维化减少52%，几乎恢复至正常水平（P＜0.05）。

Fig.1 Pathological changes in myocardial tissue of type 2 diabetic rats by HE staining.Rats were injected with streptozocin（STZ）55 mg·kg-1for one time，and then were ig given alogliptin（Alog）5 mg·kg-1per day for another twelve weeks.Arrow shows the pathological change of myocardial tissue.

Fig.2 Pathological changes in myocardial tissue of type 2 diabetic rats by Masson staining.See Fig.1 for the rat treatment.IA：integrated absorbtion.B：semi-quantitative results of A.±s，n=4-7.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with DM2 group.Arrows show the collagen accumulation of myocardial tissue.

2.3 Alog降低2型糖尿病模型大鼠心肌组织中胶原Ⅰ型和胶原Ⅲ型的表达

Fig.3 Effect of Alog on protein expression of collagenⅠand collagenⅢin myocardial tissue of type 2 diabetic rats by immunohistochemistry（lHC）.See Fig.1 for the rat treatment.A and C：protein expression of CollagenⅠand collagen Ⅲwere detected by immunohistochemistry；B and D：semi-quantitative result of A and C，respectively.±s，n=5-10.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with DM2 group.Arrows show the protein expression of collagenⅠand Ⅲ.

免疫组化法检测大鼠心肌组织中胶原表达（图3），箭头指示位置的棕色为胶原表达，较正常对照组相比，DM2组大鼠心肌组织中胶原Ⅰ型和胶原Ⅲ型表达明显增多，分别约为正常对照组的5.2倍和1.4倍（P＜0.05）；Alog治疗后大鼠心肌组织中胶原Ⅰ型、胶原Ⅲ型表达量显著性降低，分别降低71%和28%（P＜0.05），说明Alog能降低心肌组织中胶原的表达，减轻心肌纤维化。

2.4 Alog对2型糖尿病模型大鼠心肌组织胶原Ⅰ型、胶原Ⅲ型和TGF- β1蛋白表达的影响

Western印迹法检测胶原Ⅰ型、胶原Ⅲ型和TGF-β1蛋白表达（图4）。与正常对照组相比，DM2组大鼠心肌胶原Ⅰ型、胶原Ⅲ型及TGF-β1蛋白表达水平显著提高，分别为正常对照组的1.6，1.7和1.8倍（P＜0.05），而Alog能够下调大鼠心肌组织中胶原Ⅰ型、胶原Ⅲ型及TGF-β1蛋白表达，分别比DM2组降低19%，34%和45%（P＜0.05）。

2.5 Alog对2型糖尿病模型大鼠心肌组织T βRⅡ，TAK1，P38-MAPK和p-JNK的影响

Fig.4 Effect of Alog on protein expressions of collagenⅠ，collagen Ⅲ and transforming growth factor- β1（TGF- β1）in myocardial tissue of type 2 diabetic rats by Western blotting.See Fig.1 for the rat treatment.B：semi-quantitative results of A.±s，n=4.＊P＜0.05，compared with normal control group，#P＜0.05，compared with DM2 group.

Fig.5 Effect of Alog on protein expression of transforming growth factor- β receptorⅡ（T βRⅡ），transforming growth factor activated kinase 1（TAK1），P38 mitogen-activated protein kinase（P38-MAPK）and phosphorylation of c-jun N-terminal kinase（p-JNK）in myocardial tissue of type 2 diabetic rats by Western blotting.See Fig.1 for the rat treatment.B and D：semi-quantitative results of A and C.±s，n=4.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with DM2 group.

为进一步研究Alog对DM2模型大鼠心肌纤维化的作用是否与TGF-β1诱导的非Smad依赖的P38-MAPK信号通路有关，采用Western印迹法检测大鼠心肌组织中的TβRⅡ，TAK1，P38-MAPK及p-JNK的表达水平。与正常对照组相比，DM2组的TβRⅡ，TAK1，P38-MAPK和p-JNK表达显著上升，分别为正常对照组的1.9，2.0，1.8和1.5倍（P＜0.05）（图5）。与DM2组相比，Alog治疗组TβRⅡ，TAK1，P38-MAPK和p-JNK表达明显降低，分别降低38%，34%，39%和35%（P＜0.05）。

3 讨论

本研究结果显示，高糖高脂联合STZ诱导的DM2模型大鼠中，心肌细胞发生明显紊乱现象，胶原纤维大量累积，提示DM2模型大鼠MF模型的成功构建。给予Alog治疗后DM2模型大鼠心肌细胞形态结构出现一定程度的恢复，且胶原表达显著性降低，说明Alog能对DM2模型大鼠心肌纤维化起到一定的调控作用。同时蛋白表达检测结果显示，DM2组大鼠心肌细胞中TGF-β1及TβRⅡ的表达增加，同时p-JNK、P38-MAPK及其上游激酶TAK1的表达也显著增加；给予Alog治疗后大鼠心肌组织中TGF-β1及 TβRⅡ的表达显著降低，p-JNK，P38-MAPK和TAK1的表达也有不同程度的降低，Alog对DM2肌大鼠心肌纤维化起到一定的治疗作用，而Alog的抗纤维化作用可能与非Smad依赖的TGF-β1/P38-MAPK信号通路有关。

DMMF作为多种心脏疾病发展到一定阶段的共同特征主要表现为成纤维细胞过度增殖及胶原蛋白过度沉积。在正常生理情况下，心肌胶原的合成和降解受复杂的生长因子网络调控，维持动态平衡状态。TGF-β1作为心肌纤维化发生发展的重要因子之一，可通过经典的TGF-β1/Smad信号通路及非Smad依赖信号通路参与DMMF的发生发展。在非Smad依赖的信号通路中，MAPK信号通路。主要包括JNK，ERK和P383大类。MAPK通过下游这3大类家族成员参与并影响成纤维细胞的增殖、迁移、分化以及ECM的沉积等，在纤维化的发生发展过程中起着促纤维化的作用［10］。本研究结果进一步验证了TGF-β1介导的P38-MAPK信号通路参与DMMF进程。而Alog作为新一代DPP-4抑制剂降糖药物，多篇文献已报道Alog可改善DM状态下心肌损伤，缓解心肌纤维化［8，11-12］。同样，本研究结果显示，Alog能改善DM2大鼠心肌纤维化，且这种调节与TGF-β1介导的P38-MAPK信号通路有关。

目前，Alog对心肌纤维化的保护机制研究主要集中在经典的TGF-β1/Smads信号通路，对于非Smad依赖的信号通路鲜有报道。因此，本研究结果可为Alog抗心肌纤维化提供新的理论依据。同时鉴于目前尚无有效抗纤维化策略的现状，心肌纤维化相关的其他信号通路的研究既可为心肌纤维化的发生机制提供新的理论支持，也可为心肌纤维化的药物治疗提供新的靶点。由于本研究只在大鼠DM2模型中探讨了Alog通过P38-MAPK信号通路对心肌纤维化的调控机制，实验设计存在一定的局限性。今后应在细胞水平上进一步深入阐述Alog的抗心肌纤维化机制。