可溶性靶点分子对生物制品抗药抗体桥连法检测的挑战和应对策略

邵 雪＊，洛文靖＊，王海学，王庆利，任欣怡，宫新江

（1.国家药品监督管理局药品审评中心，北京 100022；2.上海益诺思生物技术股份有限公司，上海 201203）

生物制品进入机体后，通常会引起体液和（或）细胞免疫机制介导的免疫应答，由免疫应答引起的不良反应多是体液免疫机制介导的，因此特异性抗药抗体（anti-drug antibodies，ADA）一直是评价该类药物免疫原性的主要标准［1-2］。ADA可能通过影响治疗性蛋白与其靶点之间的药效学作用或改变其药动学特征而影响药效，在某些情况下还可能会引起严重的不良反应甚至危及患者生命［3］。各监管机构如欧洲药品管理局、美国食品药物管理局和中国药品监督管理局高度关注生物制品导致的ADA产生情况及可能的临床后果，建议研究者应充分考虑产品特点、患者和预期的临床目标，开发灵敏度高、特异性强的检测方法进行多层次分析［4］，包括筛选试验、确证试验、滴度试验和（或）中和抗体试验及ADA分型试验等。目前，ADA的检测主要有直接法和桥连法。在直接法中，药物捕获ADA后加入种属特异性的抗体进行检测。该法存在种属限制，且无法检测所有亚类的ADA，尤其不适用于抗体类药物临床ADA的检测。在桥连法中，药物捕获ADA后加入标记的药物，对形成的药物-ADA-药物复合物进行检测。桥连法不受种属限制，可检测所有亚类的ADA（如IgM和IgG）和除IgG4外大部分亚型而应用更广［5-6］。

桥连法检测ADA易受多种因素影响，血液循环中可溶性靶点分子是常见的干扰因素之一。常见的影响ADA检测的可溶性靶点分子包括：IgE［7］；生长因子如血管生成素［8］、神经生长因子［9］和血管内皮生长因子［10］；细胞因子如肿瘤坏死因子α［11-13］、白细胞介素5（interleukin-5，IL-5）［14］；糖基化可溶性靶点［15］和脱落的细胞膜蛋白［16］等。可溶性靶点分子会引起假阳性或假阴性结果，进而影响药物免疫原性风险的评估，因此开发可降低可溶性靶点分子干扰的ADA检测方法非常关键。本文讨论可溶性靶点分子对桥连法检测的潜在影响及相应的应对策略，以期为ADA检测方法开发提供一定参考。

1 可溶性靶点分子对桥连法检测的影响

作为ADA检测的首选方法，桥连法易受基质中多种因素影响，包括类风湿因子［17］、高浓度药物和可溶性靶点分子等。通过试验条件优化如增加阻断剂、样品预处理如阿斯巴甜处理［18］或酸化，可减轻类风湿因子及过量药物的影响，提高检测方法的灵敏度和特异性。但不同疾病基质中可溶性靶点分子差异较大，目前仍未形成统一、便捷的解决方式。

除药物本身即靶向的可溶性靶点分子外，由于疾病导致的生理差异，在血液中还可能存在从细胞膜表面脱落的靶点受体、因细胞裂解而释放的胞内靶点等可溶性靶点分子。可溶性靶点分子产生影响主要包括给药前体内高浓度的可溶性靶点分子可能干扰ADA检测、与真实药前数据偏离及对药物免疫原性风险的判断；个体间可溶性靶点分子浓度不同，检测结果药前ADA个体差异大［19］，不利于临界值的确定［20］。在某些情况下，虽给药前较低的可溶性靶点分子浓度不会影响ADA检测，但给药后靶点受体从细胞膜脱离水平增加、内在负反馈机制导致可溶性靶点分子分泌增多、靶点分子与药物结合导致清除减慢和浓度增加等原因亦可能干扰ADA检测［21-22］。

不同试验条件下，可溶性靶点分子的物理化学特征及其与药物的相互作用、亲和力大小决定了对ADA检测干扰的程度。基质中可溶性靶点形成的二聚体或多聚体直接与捕获试剂和检测试剂桥连而出现假阳性信号；而单体靶点分子与ADA竞争结合捕获试剂导致假阴性结果［17］。此外，采用酸解离“药物-ADA”复合物的同时会释放与药物（如单抗、融合蛋白）结合的靶点分子［22］，造成基质中的靶点浓度迅速升高（可达数量级改变，如机体接受靶向血管内皮生长因子的单抗或融合蛋白治疗时），反而可能会导致异常的假阳性或假阴性结果［23］。

2 应对可溶性靶点分子干扰的策略

目前，常用于降低可溶性靶点分子干扰的方法包括加入抗可溶性靶点分子抗体或受体、分离ADA、去除可溶性靶点分子、加入凝集素和检测人可溶性IgG抗体的Fcγ受体I（hsFcγRI）等（各方法优缺点及适用条件见表1）。在方法开发过程中应仔细考虑并权衡每种策略的优缺点及可能存在的风险，选择易操作、效果显著、风险较小的策略；若单一策略无法满足需求，可尝试将2种或多种策略结合以达到目的。

2.1 加入抗可溶性靶点分子抗体

在筛选实验或确证实验中加入抗可溶性靶点分子的特异性抗体（商品化产品或自行制备）可降低游离靶分子的干扰。一般情况下，在观察到有可溶性靶点干扰后可首先尝试制备多个特异性抗体，通过实验设计［21］以筛选出可减轻干扰、不影响ADA检测的抗体。该方法简单易操作，通量较高；若在方法学验证期间即采用该方法，可明显降低空白个体的背景值差异，有利于临界值的确定。去除血管生成素、血管内皮生长因子和细胞因子等干扰均可采用该方法。

为降低曲巴尼布（trebananib，AMG-386）ADA检测中血管生成素造成的干扰，Zhong等［8］在检测试剂中分别加入3种针对人血管生成素的高亲和力单克隆抗体MAb1，MAb2和MAb3。结果显示，MAb3可有效抑制血管生成素的干扰。

同样，克服膜蛋白CD20对奥法木单抗（全人源抗CD20单克隆抗体）ADA检测的干扰时，Chen等［16］在确证试验中采用了其100 mg·L-1与相同浓度的利妥昔单抗（另一抗CD20人鼠嵌合单克隆抗体）的混合溶液与样品共同孵育，可排除假阳性结果。奥法木单抗和利妥昔单抗虽与CD20结合位点不同，但二者的结合位点在空间上位置接近。由于暴露于细胞微泡表面的CD20空间体积较小，利妥昔单抗与CD20结合后产生的空间位阻，可阻碍奥法木单抗与CD20结合，进而抑制CD20对奥法木单抗ADA检测的干扰。此外，经试验证实，加入利妥昔单抗不会影响正常ADA的检测。Mikulskis等［21］亦采用加入抗游离血管内皮生长因子抗体，去除雷珠单抗ADA检测中游离血管内皮生长因子的干扰；加入IL-5的特异性结合抗体50 mg·L-1，可有效降低IL-5造成的ADA检测时的假阳性信号，去除IL-5的干扰［14］。

若采用上述方法，抗可溶性靶点分子抗体设计需注意其结构序列应与药物骨架不同、或与药物不存在或较少存在同源性序列，否则会造成ADA与抗可溶性靶点分子抗体的交叉反应。在模拟真实样品情况确定检测方法后，一定要用该法检测真正样品（临床前或临床），以评估该法是否会影响ADA检测［24］。

2.2 加入可溶性靶点受体

考虑药物的作用机制，若药物通过与靶点结合而抑制靶点与其受体结合，可采用向基质中加入过量的可溶性受体以排除干扰。通常，靶点与其受体亲和力较高，因此加入受体可有效抑制可溶性靶点干扰。

有研究表明，ADA检测实验中阳性信号值随加入受体浓度的升高而降低，但不能完全抑制可溶性靶点的影响；而引入弱酸性环境后，低浓度的受体即可完全抑制可溶性靶点的影响［24］。去除抗IgE抗体ADA检测中IgE的干扰可考虑加入IgE的受体。

但该法可能出现的问题是，即使加入极其过量的可溶性受体也无法减轻干扰。造成以上情况的原因可能有以下几点：①受体的制备技术限制，体外无法生产出和天然受体完全相同的重组受体，导致无法和可溶性靶点有效结合。如天然受体在细胞表面表达，体外生产的重组可溶性胞外区结构可能与其天然结构不同；②药物与靶标的亲和力极高，靶标很难与可能低亲和力的可溶性受体结合［21］。除此之外，还应结合受体生产量是否可满足样品检测的需求、受体生产的成本进行考虑采用该法的必要性。

表1 排除可溶性靶点干扰各方法优缺点及适用条件

2.3 分离ADA

若不能获得满足要求的针对可溶性靶点分子的抗体或受体，可尝试将样品中的ADA预先从基质中分离纯化出来，再用于检测。该法无需大量的、针对可溶性靶点分子的高亲和力抗体或受体，可应用于大部分试验。但预处理过程可能导致ADA部分丢失；由于增加了样品预处理步骤，操作过程较为复杂，试验通量较小。此外，该法可能需特殊的仪器及耗材。

酸化-磁珠提取（bead extraction and acid dissociation，BEAD）法可较好分离ADA［25］。其主要通过样品进行酸化处理释放所有ADA后加入大量含生物素标记的药物捕获ADA达到目的。

BEAD法不仅可有效降低可溶性靶点分子及基质中其他物质的干扰，也可提高方法的灵敏度和药物耐受程度。但由于多次引入酸化步骤，可能导致ADA降解、结构改变或ADA分离不完全，使ADA检测信号值低于真实值。因此，在方法学开发阶段需确认该法对于ADA检测无影响后，再用于样本检测。类似地，根据药物及靶点特征，选择热解离处理样品，然后采用磁珠分离ADA即热解离-磁珠纯化（bead-extraction and heat-dissociation，BEHD）法，也可排除可溶性靶点分子的干扰［26］。

先经过亲和捕获ADA，然后采用桥连接法进行分析［27］，即将样品与加入生物素标记的药物在包被链霉亲和素板上过夜孵育，随后经酸化处理将捕获的ADA解离后进行桥连试验检测也可有效减弱可溶性靶点分子的干扰。

另外，Zoghbi等［23］亦开发了一种可克服可溶性靶点分子干扰的方法，即预沉淀-酸化法。首先，向样本中加过量药物，使基质中全部游离的ADA与药物形成复合物；其次，加入聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）沉淀ADA-药物复合物将ADA全部分离出来；然后，酸化处理释放ADA，在高亲和力板中孵育检测。采用该法可有效去除游离肿瘤坏死因子α的干扰［11］。但需注意的是，PEG浓度越高，分子质量越小的物质越易沉淀。因此，摸索加入的PEG浓度非常重要。此外，不同批号的PEG沉淀效果可能不同，试验中需注意试剂批次引起的检测误差。最后，在临床样本检测中需考虑相同批号PEG存量的问题。

2.4 去除可溶性靶点分子

除了从样品中分离ADA，还可通过固相提取去除可溶性靶点分子以消除干扰。其基本原理是将样本与包被了特异性结合可溶性靶点的单抗或配体的磁珠或板共孵育后，离心去除磁珠或从板吸出溶液即可去除可溶性靶点。Dai等［9］采用该法有效去除了呋拉奴单抗（fulranumab）ADA检测时神经生长因子的干扰。但此法通用性广而通量较低，ADA可能会部分丢失。

2.5 加入凝集素（抑制糖基化可溶性靶点干扰）

凝集素可特异性地结合糖基化复合物的糖基，因此加凝集素后能抑制糖基化可溶性靶点造成的ADA 检测干扰。Carrasco-Triguero 等［15］向已加CA125的混合血清中分别加入麦胚凝集素、植物血凝素E及植物血凝素M。结果显示，麦胚凝集素500 mg·L-1可明显降低游离CA125导致的高信号值，显著改善内源性CA125的干扰。需注意的是，由于凝集素可与人免疫球蛋白的糖基结合，需评估加入凝集素是否会同时干扰真实的ADA检测。此外，他们采用表面等离子体共振技术研究发现麦胚凝集素不会与人IgG及3A5 TDC抗体部分结合［15］。因此，可考虑选择麦胚凝集素去除游离CA125的干扰。

2.6 采用Pro329Gly修饰hsFc γRI检测

若抗体药物的Fc结构域含Pro329Gly修饰，可利用该修饰位点设计ADA检测方法，避免基质中可溶性靶点分子和过量药物的干扰。试验原理简述如下：首先加过量药物，使基质中全部游离的ADA与药物形成复合物；随后采用生物素标记的抗Pro329Gly的抗体捕获ADA-药物复合物；加地高辛标记的hsFcγRI进行检测［28-29］。与常规桥连试验相比，该法可特异性地检测ADA，有效避免可溶性靶点分子的干扰；对于天然抗体的检测灵敏度较好，有利于评估给药后的ADA产生。但该法需对抗体Fc进行Pro329Gly修饰，仅能检测IgG1抗体，不能检测其余ADA亚型，因此适用范围极小。

2.7 两种策略结合法

以上介绍方法均为单一策略。若单一策略效果并不理想，可同时引入2种策略。一般不建议同时引入超过2种方法来排除干扰，防止过多处理步骤造成ADA损失形成假阴性结果及引入过多人为因素而影响结果。

Chen等［22］发现，在加入抗可溶性靶点抗体HuAb2和HuSR蛋白（靶点受体胞外区与人IgG Fc融合蛋白）后，可抑制药物REGN-X靶点的干扰。但HuAb2具有与REGN-X相同的人IgG4恒定区，HuSR具有人IgG Fc。因此，患者血清中任何针对REGN-X的IgG4恒定区或Fc的ADA均可能与HuAb2或HuSR结合，也会干扰针对REGN-X CDR区ADA的检测。因此，将HuSR的人Fc和HuAb2的人IgG4恒定区变为小鼠相应序列，进一步有效降低了临床样本中靶点干扰。同时在加入2种靶点阻断剂后，当检测体系为pH8.3的条件下，可更好地促进靶点与阻断剂结合，完全抑制REGN-X靶点干扰。

3 结语

综上，可溶性靶点分子的存在会影响药物ADA的检测及结果判断，进一步影响对药物药动学、有效性及安全性的评估。可溶性靶点分子对生物制品ADA检测的干扰受多种因素影响，包括药物及靶点的物理化学特点、药物与靶点的相互作用、药物的作用机制、选择的实验方法等。在不同的病理状态及给药情况下，机体内可溶性靶点分子的水平经常会发生变化。因此，鉴定和评估可溶性靶点对ADA检测的影响，并开发可减轻可溶性靶点分子干扰的分析方法非常重要，也颇具挑战。基于风险评估，在ADA方法开发初期，应根据药物的作用机制、靶点的生物学特点、给药后的生理代偿等提前评估相关可溶性靶点对检测的可能干扰。若可溶性靶点干扰大，应充分参考靶点及药物作用特性，尝试多种方法，以选择最方便经济可靠的方法去除可溶性靶点干扰，同时不影响真实ADA检测。在选择特定方法后，应用真实样本检测以进行进一步佐证。需注意的是，即使是相同靶点的药物，可溶性靶点分子对其ADA检测的影响可能是不同的。因此，一种药物的去除方法应经完全评估后才能应用于另一药物的ADA检测。总之，可溶性靶点分子对生物制品ADA检测面临较多挑战，应根据药物及可溶性靶点特性制定相应的应对策略。