中药康莱特联合放化疗对Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用及机制

姚 健＊，信红亚，3＊，曾贵荣＊，石镇港，吴莉峰，徐永兴，袁湘中，王 平

（1.吉林省人民医院，吉林长春 130021；2.湖南省药物安全评价研究中心暨新药药效与安全性评价湖南省重点实验室，湖南 长沙 410331；3.中南大学湘雅医院，湖南 长沙 410008）

放射治疗作为治疗肺癌的主要手段之一，在杀伤肿瘤细胞的同时，会损伤免疫细胞，且伴随着一些严重的副作用，如骨髓抑制和消化道反应等［1］。因此，探讨有效治疗方法预防、减轻或遏制肿瘤放疗患者不良反应的发生、提高患者生存质量具有重要意义。近年来研究证实，中医药联合放疗能通过调节免疫、抗氧化应激、抗炎、维持肠道微生物平衡等发挥作用［2］。前期临床研究发现，中药康莱特（主含薏苡仁）注射液（Kanglaite injection，KI）、康莱特软胶囊（Kanglaite soft capsule，KC）配合化疗均能明显提高晚期非小细胞肺癌患者免疫功能，提高患者生存质量，减轻副作用［3］。而KI和KC联合放化疗对非小细胞肺癌治疗作用未见报道。因此，本研究对KI和KC联合放化疗对Lewis肺癌小鼠的抑瘤作用进行探讨，为其临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物、细胞、试剂和主要仪器

雄性C57BL/6小鼠116只，体质量12～15 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物合格证号（43004700046836）；伦理审查编号为2018（3）014，在湖南省药物安全评价研究中心屏障环境饲养，温度：20～26℃、相对湿度：40%～70%、每日12 h/12 h交替照明，小鼠自由进食和饮水。小鼠Lewis肺癌细胞，购于中国科学院细胞库，用DMEM培养基加10%新生牛血清，置37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。KI（批号：1803136-1，规格：10 g/100 mL）；KC（批号：20180302，规格：0.45 g/粒，浙江康莱特药业有限公司）。顺铂注射液（批号：170905，规格：30 mg/6 mL，江苏豪森药业集团有限公司）。水合氯醛（批号：20171221，国药集团化学试剂有限公司）。用FITC-CD3小鼠单抗（货号11-0032-82）、APCCD4小鼠单抗（货号17-0041-820）和PE-CD8a小鼠单抗（货号12-0081-82）（均为美国Thermofisher公司产品），X-RAD 225 Cx小动物精确放疗系统（美国SARRP公司）；数显游标卡尺（永康正丰五金有限公司）；Accuri C6流式细胞仪（美国BD公司）；DFC 420C型病理成像系统（德国Leica）。

1.2 荷瘤小鼠制备及处理分组

取对数生长期Lewis肺癌细胞，调整细胞浓度为1×1010L-1细胞液接种于20只雄性C57BL/6小鼠右侧腋下，每只小鼠接种0.2 mL（约2×106个细胞），待肿瘤组织≥500 mm3，剥离肿瘤组织按体积1∶1加细胞培养液，用匀浆器制备细胞悬液接种于84只雄性小鼠背部，肿瘤体积≥200 mm3且无溃破时，荷瘤小鼠模型制备成功。

按瘤体体积兼顾体质量分为7组，每组12只，分别为：荷瘤模型组、放疗（Rad）组、放疗+5 d顺铂2 mg·kg-1（Rad+Cis×5）组（iv给药）、放疗+5 d KI组（Rad+KI×5）、放疗+5 d KI+11 d KC组（Rad+KI×5+KC×11）、放疗+16 d KI组（Rad+KI×16）、放疗+顺铂2.0 mg·kg-1+5 d KI+11 d KC组（Rad+Cis+KI×5+KC×11），KI均按13 mL·kg-1iv给予，KC按1.4 g·kg-1ig给予。另取12只C57BL/6小鼠作为正常对照组。除正常对照组外，其余小鼠采用225 Cx放疗系统进行瘤体放疗，方法如下：采用10%水合氯醛ip麻醉小鼠，置自制铅衣中、暴露肿瘤组织进行放疗，放射强度为2 Gy·d-1，连续照射5 d，正常对照组、荷瘤模型组和Rad组小鼠按20 mL·kg-1静脉给予0.9%氯化钠注射液，其余各组按实验设计分别给予相应药物，16 d后，各组小鼠取血、胸腺和脾进行相关指标检测。

1.3 计算小鼠死亡率

记录每天小鼠死亡情况，小鼠死亡率（%）=死亡小鼠数/总小鼠数×100%。

1.4 测量瘤体积和瘤重

每3天用游标卡尺测量肿瘤组织最长径（a）和最短径（b），瘤体积（V）=1/2ab2。末次给药后解剖取肿瘤组织称重（g），抑瘤率（%）=（荷瘤模型组瘤重-给药组瘤重）/荷瘤模型组瘤重×100%。

1.5 血液生化仪检测血常规

末次给药后小鼠眼眶取血，采用血液生化仪检测血常规：白细胞（white blood cells，WBC）和红细胞（red blood cells，RBC）计数，血红蛋白（hemoglobin，Hgb）含量。

1.6 流式细胞仪检测外周血CD3+CD4+和CD3+CD8+细胞亚群百分比

末次给药结束后取血，用5倍量RBC裂解液裂解RBC，用CD3，CD4和CD8抗体0.25 mg·L-1进行标记，孵育后上机检测。

1.7 骨髓涂片观察巨核细胞、红细胞系和粒细胞系变化

末次给药后取股骨进行骨髓涂片，分离小鼠一侧完整股骨，剪去两端骨骺，用PBS将全部骨髓冲洗至2 mL离心管，进行骨髓涂片，观察巨核细胞、RBC系和粒细胞系有无细胞增生、细胞发育异常。巨核细胞的发育异常主要表现为巨核细胞不能分叶或分叶减少和小核巨核细胞等。RBC系细胞发育异常主要表现为幼红细胞可见多核、异形核及类巨变等，补充维生素B12、叶酸后RBC形态异常不能纠正。粒细胞系细胞发育异常表现为胞浆颗粒缺少、类巨变、异形核、假性Pelger-Hüet畸形等。

1.8 脏器指数计算

末次给药后解剖取胸腺、脾并称重，计算脏器指数（脏器指数＝脏器质量/动物体质量×100，单位为g·100 g-1）

1.9 HE染色观察胸腺和脾组织病理变化

将胸腺、脾用10%甲醛进行固定，石蜡切片进行HE染色，在光学显微镜下观察胸腺、脾组织病理变化。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 康莱特联合放化疗对荷瘤小鼠死亡率的影响

小鼠死亡率结果（图1）显示，与荷瘤模型对照组比较，Rad+Cis+KI×5+KC×11，Rad+KI×5和Rad+KI×16各组小鼠死亡率明显降低（P＜0.01）。与Rad组比，Rad+Cis+KI×5+KC×11，Rad+Cis×5和Rad+KI×16，Rad+KI×5各组小鼠死亡率明显降低（P＜0.05，P＜0.01），但是Rad+KI×5+KC×11组小鼠死亡率升高（P＜0.05）。与Rad+Cis组比，Rad+KI×5 组小鼠死亡率明显降低（P＜0.05），提示KI和KC联合放化疗能明显提高小鼠生存率。

Fig.1 Effect of Kanglaite combined with chemoradiotherapy on death rate of Lewis lung cancer mice.Totally 84 tumor-bearing mice with tumor size over 200 mm3were collected and divided into seven groups according to tumor size and mass：tumor-bearing model group，radiation therapy（Rad）group，Rad+cisplatin 2 mg·kg-1（Rad+Cis）group，Rad+5 d Kanglaite injection（KI）13 mL·kg-1（Rad+KI×5）group，Rad+5 d KI+11 d Kanglaite soft capsule（KC）1.4 g·kg-1（Rad+KI×5+KC×11）group and Rad+KI×16 group，Rad+Cis+KI×5+KC×11 group，the tumor-bearing mice underwent radiation therapy for 5 d，radiation intensity was 2 Gy per day.±s，n=12.＊＊P＜0.01，compared with model group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with Rad group；△P＜0.05，compared with the Rad+Cis×5 group.

2.2 康莱特联合放化疗对荷瘤小鼠瘤体积的影响

与荷瘤模型对照组比较，Rad+Cis+KI×5+KC×11组小鼠给药第6～15天瘤体积明显降低（P＜0.05，P＜0.01）；Rad+KI×5和Rad组小鼠第6和9天瘤体积明显降低（P＜0.05），Rad+Cis×5组小鼠第9天瘤体积明显降低（P＜0.05），与Rad 组、Rad+Cis×5组比较，Rad+Cis+KI×5+KC×11组小鼠给药第12～15天瘤体积明显降低（P＜0.01），提示KI和KC联合放化疗对Lewis肺癌荷瘤小鼠具有明显的抑瘤作用（表1）。

2.3 康莱特联合放化疗对荷瘤小鼠瘤重的影响

小鼠瘤重结果（图2）显示，与荷瘤模型对照组比较，除Rad+KI×5+KC×11组无统计学差异外，其他组小鼠瘤重明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。与Rad组、Rad+Cis组比，Rad+Cis+KI×5+KC×11组小鼠瘤重明显降低（P＜0.05），提示KI和KC联合放化疗能明显降低小鼠瘤重。

Fig.2 Effect of Kanglaite combined with chemradiotherapy on tumor mass in Lewis lung cancer mice.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=12；＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with model group；#P＜0.05，compared with the Rad group；△P＜0.05，compared with the Rad+Cis×5 group.

2.4 康莱特联合放化疗对荷瘤小鼠RBC，Hgb和WBC的影响

小鼠RBC，Hgb和WBC结果（图3）显示，与正常对照组比较，荷瘤模型对照组小鼠RBC数、Hgb含量明显降低（P＜0.01），WBC数明显升高（P＜0.05）。与荷瘤模型对照组比较，Rad+Cis+KI×5+KC×11和Rad+KI×16组小鼠RBC数和Hgb含量明显升高（P＜0.05），提示Rad+Cis+KI×5+KC×11和Rad+KI×16具有明显的升RBC和Hgb的作用。与Rad和Rad+Cis×5组比，各药组RBC数，Hgb含量无统计学差异。与荷瘤模型对照组比较，Rad+Cis+KI×5+KC×11组和Rad+Cis×5组小鼠WBC数明显降低（P＜0.01）。与Rad+Cis×5组比，Rad+KI×5，Rad+KI×5+KC×11和Rad+KI×16各组小鼠WBC数明显升高（P＜0.05）。

Tab.1 Effect of Kanglaite combined with chemoradiotherapy on tumor volumes of Lewis lung cancer mice

Fig.3 Effect of Kanglaite combined with chemoradiotherapy on red blood cell（RBC），hemoglobin（Hgb）and white blood cell（WBC）in Lewis lung cancer mice.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=12. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.05，compared with model group；△P＜0.05，compared with the Rad+Cis×5 group.

2.5 康莱特联合放化疗对荷瘤小鼠胸腺和脾指数的影响

与正常对照组比较，荷瘤模型对照组小鼠胸腺指数明显降低（P＜0.01），脾指数明显增加（P＜0.01）。与荷瘤模型对照组比较，Rad+Cis+KI×5+KC×11组小鼠胸腺指数明显增加（P＜0.05），脾器指数明显降低（P＜0.05），Rad组Rad+KI×5组和Rad+IK×16组小鼠胸腺器指数明显增加（P＜0.05）。与Rad组和Rad+Cis×5组比较，各给药组小鼠胸腺和脾指数无统计学差异（图4）。

Fig.4 Effect of Kanglaite combined with chemoradiotherapy on thymus and spleen coefficients in Lewis lung cancer mice.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=12.＊P＜0.05，compared with normal control group.#P＜0.05，compared with model group.

2.6 康莱特联合放化疗对荷瘤小鼠外周血CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞亚群百分比的影响

与正常对照组比较，荷瘤模型对照组小鼠外周血CD3+CD4+T淋巴细胞亚群百分比明显降低（P＜0.05）。与荷瘤模型组相比，Rad+Cis+KI×5+KC×11、Rad、Rad+Cis×5和Rad+KI×16各组小鼠外周血CD3+CD4+T淋巴细胞亚群百分比明显升高（P＜0.05）。与Rad组和Rad+Cis×5组比较，各给药组小鼠外周血T淋巴细胞亚群CD3+CD4+百分比无明显差异。各组小鼠外周血CD3+CD8+T淋巴细胞亚群百分比无明显差异（图5）。

2.7 康莱特联合放化疗对荷瘤小鼠骨髓细胞的影响

正常对照组小鼠骨髓巨核细胞核体积大，胞浆丰富，骨髓有核细胞增生活跃，成熟红细胞和有核细胞的比例大致正常，红细胞系和粒细胞系大量存在，分布集中。在荷瘤模型组中，巨核细胞减少（P＜0.01），红细胞系和粒细胞系遭到破坏，分布较为疏散。给药后，Rad+Cis+KI×5+KC×11，Rad+KI×5+KC×11和Rad+KI×16各组小鼠骨髓有核细胞明显增加（P＜0.01，P＜0.05），与Rad+Cis×5组比较，Rad+Cis+KI×5+KC×11，Rad+KI×5+KC×11和Rad+KI×16各组小鼠骨髓有核细胞明显增加（P＜0.05）（图6）。

Fig.5 Effect of Kanglaite combined with chemoradiotherapy on CD3+CD4+and CD3+CD8+percentage of T lymphocyte subsets in peripheral blood of Lewis lung cancer mice.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=12.＊P＜0.05，compared with normal control group.#P＜0.05，compared with model group.

2.8 康莱特联合放化疗对荷瘤小鼠胸腺和脾组织病理变化的影响

荷瘤模型对照组小鼠脾红髓造血明显，细胞类型多样，红细胞系、粒细胞系、巨核细胞均增生，胸腺萎缩，残存部分小叶，皮髓质分界不清。Rad+Cis+KI×5+KC×11组小鼠脾白髓仅见少量淋巴组织，红髓造血明显，细胞类型多样，以粒细胞系为主，胸腺萎缩，皮髓质分界不清。与Rad组和Rad+Cis×5组比较，Rad+Cis+KI×5+KC×11组小鼠脾白髓红髓造血明显，细胞类型多样，以粒细胞系为主（图7）。

Fig.6 Effect of Kanglaite combined with chemoradiotherapy on bone marrow cells in Lewis lung cancer mice.See Fig.1 for the mouse treatment.B was count of bone marrow nucleated cells（BMNCs）of A.±s，n=12.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with the normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with the model group；△P＜0.05，compared with the Rad+Cis×5 group.The arrows show megakaryocytes.

Fig.7 Effect of Kanglaite combined with chemoradiotherapy on pathology of spleen and thymus in Lewis lung cancer mice by HE staining.See Fig.1 for the mouse treatment.The black arrows show extramedullary hematopoietic granulocytes of the spleen and the shrunken thymus.The red arrows show the medulla，and the thymus is atrophic.

3 讨论

本研究发现，Rad+KI×5、Rad+KI×16能明显降低小鼠死亡率，降低瘤体积和瘤重，提示KI联合放疗具有明显抑瘤作用。其次，Rad+KI×16能明显升高小鼠血常规指标RBC和Hgb含量，Rad+KI×5、Rad+KI×16对小鼠骨髓抑制有明显的改善作用，升高小鼠外周血CD3+CD4+T淋巴细胞亚群百分比，Rad+KI×5能明显增加胸腺指数，且对胸腺、脾病理学变化未见异常，提示KI联合放疗对骨髓造血抑制具有一定的修复作用，且无明显的副作用。与Rad+Cis×5组比较。Rad+Cis+KI×5+KC×11组小鼠死亡率明显降低，瘤体积和瘤重降低，提示KI和KC联合放化疗抑瘤作用优于放化疗。Rad+Cis+KI×5+KC×11能明显升高血常规指标RBC和Hgb含量、外周血CD3+CD4+T淋巴细胞亚群百分比，对胸腺和脾器指数及组织病理变化无明显影响。提示KI和KC联合放化疗能明显改善骨髓抑制，且能减少放化疗对免疫器官的副作用。Rad+KI×5+KC×11组小鼠死亡率升高，KI联合放疗6 d瘤体积有降低趋势，ig KC至给药结束，瘤体积、瘤重变化与模型对照组无明显差异，提示KI联合放疗前期给药有明显的抑瘤作用，而后单独给予KC效果不明显，因此小鼠死亡率增加与后期单用ig KC作用有关。

目前癌症治疗方法主要包括手术、放疗和化疗，放疗在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞也会造成损伤，产生胃肠道反应、骨髓抑制、免疫抑制或心、肾和神经系统的损害［4］。骨髓抑制是其中最主要的副作用是导致机体免疫功能低下，主要临床表现为外周血红细胞显著减少［5］。KI为双相广谱抗癌药，临床用于肝癌和肺癌的治疗。临床研究报道，KI配合放疗能明显提高非小细胞肺癌患者的疗效及患者免疫功能，且具有增效减毒的作用，其机制可能是康莱特能改善由放疗引起的肿瘤低氧及免疫抑制微环境［6-7］。临床研究发现，KI联合放疗对肺癌患者有着明显的治疗作用，可明显降低肺癌细胞的生长和扩散［8-11］。KI和KC主要含有薏苡仁，薏苡仁中的主要抗肿瘤活性成分对肝癌、胃癌和肺癌等均具有较好疗效且副作用小［5，7］。且KC对荷瘤小鼠具有明显的免疫促进作用，能增强机体非特异性免疫和抗疲劳能力［12］。

综上所述，KI和KC联合放化疗对Lewis肺癌小鼠具有明显的增效抑瘤、减毒作用，其作用机制与增强免疫有关。该研究为提高肿瘤患者机体免疫功能、减轻放疗副作用、提高生存质量提供了新的选择。