交联聚异丁烯对小鼠巨噬细胞的细胞相容性和免疫相容性

潘邦伦，章华颖，姜丽丽，林翰超，方小娟，姜 力，李 伟，2

（1.温州医科大学检验医学院、生命科学学院，浙江 温州 325035；2.检验医学教育部重点实验室，浙江 温州 325035）

聚异丁烯（polyisobutylene，PIB）及其衍生物已广泛地应用于医疗器械领域，包括心血管载药支架涂层和青光眼引流管等。PIB因其较低的渗透性、热稳定性、弹性-可折叠性、氧稳定性和较高的粘性系数，得到越来越多的关注［1］，基于PIB的创新医疗器械正在进行更深入的临床试验。巨噬细胞作为免疫系统的重要组成部分，发挥着非特异性吞噬清除作用，介导固有免疫应答［2］。将医疗器械植入人体后，会引发巨噬细胞在材料表面黏附聚集。此外，材料的浸出物、降解物会引起炎症反应，造成纤维组织增生，最终导致植入部位的损伤和器械的老化破裂。因此，评价医疗器械对巨噬细胞的细胞相容性和免疫相容性，是衡量医疗器械生物相容性的重要标准之一［3］。目前，对于医疗器械的免疫相容性评价，主要包括器械对免疫器官和免疫细胞的影响，外周白细胞的计数分类变化和对病原微生物的易感性等［3-4］。交联PIB（x-polyisobutylene，xPIB）是基于PIB的新一代可植入性医疗器械，但其对巨噬细胞的细胞相容性和免疫相容性尚不明确。因此，本研究根据GB/T 16886.20-2015［5］和 GB/T 16886.5-2017［6］，主要围绕xPIB浸提液对RAW264.7细胞的细胞相容性和免疫相容性进行评价，探讨其在未来临床应用中可能的潜在风险。

1 材料与方法

1.1 细胞、材料、试剂和主要仪器

RAW264.7细胞（来源于Abelson啮齿类白血病病毒诱导的小鼠巨噬细胞）购自中国科学院细胞库，用DMEM培养基（含10%胎牛血清）培养，培养条件为37℃，5%CO2。疏水性丙烯酸酯（阴性对照）和xPIB材料由西安浦勒生物科技有限公司赠予，将丙烯酸酯和xPIB材料经环氧乙烷灭菌后，置培养皿中，加入完全培养基〔丙烯酸酯和xPIB为直径22mm圆形薄片，浸提比（圆片表面积与浸提液体积比）为1250 cm2·L-1〕，37℃浸提24 h，取上清，用0.22 μm滤膜过滤，直接使用或存于4℃冰箱备用［5-6］。Trizol裂解液和DMEM购自美国赛默飞世尔科技公司；胎牛血清购自舜冉（上海）生物公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）检测试剂盒、中性红染料、MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒、小鼠白细胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6、IL-12p70和肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA试剂盒均购自上海碧云天生物技术研究所；逆转录PCR试剂盒购自宝日医生物技术（北京）有限公司；SYBR购自杭州沃森生物技术有限公司；苯酚购自常熟市鸿盛精细化工有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。Varioskan Flash酶标仪和Nano-Drop 2000购自美国赛默飞世尔科技公司；CFX96 TouchTM荧光定量PCR检测系统和BioRad CFX96 Touch PCR System均购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司；5417型低温离心机购自艾本德（中国）有限公司。

1.2 MTT法检测细胞存活率

参考GB/T16886.5-2017［6］，采用苯酚作为评价医疗器械体外细胞相容性试验的阳性对照，分别用完全培养基、丙烯酸酯（100%浸提液，阴性对照）、苯酚（214 mg·L-1，阳性对照）及xPIB（25%，50%，75%和100%浸提液）处理RAW264.7细胞24，48，72，96和120 h，弃上清，加10%MTT，培养箱中孵育4 h，加DMSO溶解细胞，用酶标仪在450 nm波长下检测吸光度（A450nm）值［7］。细胞存活率（%）=（实验组A450nm-细胞对照组A450nm）/（阴性对照组A450nm-细胞对照组A450nm）×100% 。

1.3 Griess法检测细胞上清中NO水平

巨噬细胞受LPS刺激，可激活并分化为炎症型巨噬细胞，从而促进炎症反应，导致组织损伤［8-9］。因此，本研究分别用完全培养基、丙烯酸酯（100%浸提液，阴性对照）、LPS（10 μg·L-1，阳性对照）和xPIB（100%浸提液）处理细胞24和48 h，每孔加细胞上清和标准品50 μL，依次加入格里斯试剂Ⅰ50 μL和格里斯氏试剂Ⅱ50 μL，用酶标仪在540 nm波长下检测A540nm值［10］，根据标准曲线计算实验组上清中NO浓度。

1.4 中性红摄取实验检测巨噬细胞吞噬能力

细胞分组和处理方法同1.3，每孔加中性红活性染料 300 μL，培养箱中孵育 30 min，弃染料，用PBS洗涤2次，加醋酸醇裂解液裂解细胞，在4oC冰箱中过夜，用酶标仪在540 nm波长下检测A540nm值［11］。中性红摄取指数＝（实验组A540nm-细胞对照组A540nm）/（阴性对照组A540nm-细胞对照组A540nm）。

1.5 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测细胞因子mRNA水平

细胞分组和处理方法同1.3，Trizol法提取细胞RNA，用NanoDrop 2000检测RNA浓度和A260nm/A280nm比值，将所有样品的RNA调至500 mg·L-1。按逆转录试剂盒说明书进行cDNA逆转录，得到cDNA产物。进行RT-qPCR，反应体系（共20 μL）为：DEPC水7 μL，SYBR GreenⅠ10 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板2 μL。用RT-qPCR仪收集荧光信号。实时荧光定量的程序为95℃，2 min；40个循环收集荧光信号（95℃，10 s；60℃，30 s），扩增完成后，建立熔解曲线（95oC，15 s；60℃，1 min；95℃，15 s），采用 2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA表达水平。引物（序列见表1）合成委托上海桑尼生物技术有限公司，内参基因选择GAPDH。

1.6 ELlSA法检测细胞上清中的炎症相关细胞因子的水平

细胞分组和处理方法同1.3，吸取细胞上清，按试剂盒说明书进行操作，检测细胞上清中的IL-1β，IL-6，IL-12p70和TNF-α蛋白水平［12］。

1.7 观察材料表面黏附细胞的形态和数目

将已灭菌处理的丙烯酸酯和xPIB晶状体圆片置12孔板中，将RAW264.7细胞分别与2种材料孵育24和48 h，用倒置相差显微镜，低倍镜（10×10）下随机选取20个视野，统计细胞平均数，并计算1 mm2材料表面黏附的细胞数目，判断细胞黏附情况；并用LPS 10 μg·L-1刺激丙烯酸酯材料表面黏附的RAW264.7细胞24和48 h，作为巨噬细胞激活的阳性对照。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 xPlB浸提液对RAW264.7细胞存活率的影响

与细胞对照组相比，苯酚214 mg·L-1（阳性对照）处理RAW264.7细胞24～120 h后，细胞存活率显著降低（P＜0.01，图1）。用丙烯酸酯和4个浓度的xPIB浸提液分别处理RAW264.7细胞24～120 h，与细胞对照组相比，细胞存活率无显著变化。

Fig.1 Effect of liquid extracts of x-polyisobutylene（xPlB）on cell survival rate of RAW264.7 cells.RAW264.7 cells were incubated with DMEM medium containing 10%FBS，acrylate（liquid extracts 100%），phenol 214 mg·L-1and xPIB（liquid extracts 25%，50%，75%and 100%）for 24-120 h，respectively.Cell survival rate was measured with MTT method.Cell survival rate（%）=（experimental group A450 nm-cell control group A450 nm）/（negative control A450 nm-cell control group A450 nm）×100%.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.2 xPlB浸提液对NO水平的影响

与细胞对照组相比，用 LPS 10 μg·L-1刺激RAW264.7细胞24和48 h后，细胞上清中NO水平显著升高（P＜0.01，图2），而用丙烯酸酯100%浸提液和xPIB100%浸提液刺激细胞24和48 h后，上清中NO水平无显著变化。

Fig.2 Effect of liquid extracts of xPlB on concentration of nitric oxide（NO）in culture medium of RAW264.7 cells.RAW264.7 cells were treated with DMEM medium containing 10%FBS，acrylate（liquid extracts 100%），lipopolysaccharide（LPS）10 μg·L-1and xPIB（liquid extracts 100%）for 24 and 48 h，respectively.NO concentration in supernatant was measured by Griess assay.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.3 xPlB浸提液对RAW264.7细胞吞噬能力的影响

与细胞对照组相比，丙烯酸酯100%浸提液处理RAW264.7细胞24和48 h后，RAW264.7吞噬中性红颗粒的能力无明显变化；而用LPS 10 μg·L-1刺激细胞24和48 h后，吞噬能力显著增强（P＜0.01，图3）；用xPIB100%浸提液处理细胞24和48 h后，吞噬中性红颗粒的能力无显著变化。

Fig.3 Effect of liquid extracts of xPlB on phagocytic capacity of RAW264.7 cells.See Fig.2 for the cell treatment.Phagocytic capacity of RAW264.7 was measured by neutral red uptake test.Index=（experimental group A540 nm-cell control group A540 nm）/（negative control A540 nm-cell control group A540 nm）.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.4 xPlB浸提液对细胞因子、CD80、CD86和iNOS mRNA水平的影响

与细胞对照组相比，丙烯酸酯100%浸提液处理RAW264.7细胞24和48 h后，IL-1β，IL-6，IL-12b，TNF-α，CD80，CD86和iNOS的mRNA水平均无显著差异。但用LPS 10 μg·L-1刺激细胞24和48 h后，上述7项指标mRNA水平均显著升高（P＜0.01，图4）；用xPIB100%浸提液处理细胞24和48 h后，细胞因子的变化趋势与丙烯酸酯相同。

2.5 xPlB浸提液对细胞因子水平的影响

与细胞对照组相比，用丙烯酸酯100%浸提液和xPIB 100%浸提液处理RAW264.7细胞24和48 h，细胞IL-1β，IL-6，IL-12p70和TNF-α水平均无显著差异；用LPS 10 μg·L-1刺激24和48 h后，细胞上述4项指标显著升高（P＜0.01，图5）。

Fig.5 Effect of liquid extracts of xPlB on protein levels of cytokines of RAW264.7 cells measured by ELlSA.See Fig.2 for the cell treatment.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

2.6 xPlB表面黏附的RAW264.7细胞数目和形态

Fig.4 Effect of liquid extracts of xPlB on mRNA levels of cytokines and surface markers in RAW264.7 cells measured by RT-qPCR.See Fig.2 for the cell treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with cell control group.

将RAW264.7细胞与丙烯酸酯和xPIB共孵育24 h，发现丙烯酸酯表面的细胞数目是xPIB组的3.99倍（P＜0.01，图6）；共孵育48 h，丙烯酸酯表面的细胞数目是xPIB组的2.47倍（P＜0.01，图6）。

Fig.6 Number of RAW264.7 cells on surface of xPlB.RAW264.7 cells were inoculated on the surface of acrylate and xPIB for 24 and 48 h，respectively.The number of RAW264.7 cells in the area of 1 mm2was counted by phase contrast microscope.±s，n=20.＊＊P＜0.01，compared with acrylate group.

显微镜观察细胞形貌（图7），在丙烯酸酯表面的细胞呈圆形，表面光滑，很少出现伪足。用LPS 10 μg·L-1刺激丙烯酸酯表面RAW264.7细胞24和48 h，细胞变大，出现伪足，表面粗糙呈细颗粒状，胞内出现很多小空泡，处于M1活化状态。在xPIB表面的细胞形貌和丙烯酸酯相同，细胞处于未活化的静息状态（M0）。

Fig.7 Effect of xPlB on RAW264.7 cell morphology（×100）.See Fig.6 for the cell treatment.RAW264.7 cell morphology was observed by phase contrast microscope.Arrows refer to the pseudopodium structure of RAW264.7 cells.

3 讨论

医疗器械的免疫相容性评价已成为生物相容性评价的重要部分之一。已有文献报道，牙科/骨科所用的合金材料可引起Ⅰ型超敏反应，丙烯酸树脂/丙烯酸盐可诱发免疫损伤。此外，低分子有机物还会介导T细胞活化，发生Ⅳ型超敏反应［13-15］，因此评估医疗器械和生物材料的免疫相容性对于材料的应用十分重要。而xPIB作为新型人工晶状体材料，其生物相容性，尤其是免疫相容性的研究尚不充分。另外，xPIB在进行交联反应时，存在未交联的单分子异丁烯，异丁烯具有弱细胞毒性和神经毒性，影响人工晶状体的生物相容性；而且在交联反应过程中，存在金属离子如镁离子、锌离子的渗入。因此，本研究参考 GB/T 16886.20-2015［5］和GB/T 16886.5-2017［6］，采用可模拟体内植入的浸提萃取法，检测xPIB浸提液的细胞相容性和免疫相容性，并用LPS刺激丙烯酸酯表面的细胞作为植入-黏附实验的阳性对照，从而判断xPIB晶状体植入人眼后的影响。

本研究分别从功能性实验（包括免疫细胞、免疫器官活性以及免疫因子合成分泌等）和非功能性实验（包括免疫细胞的形态学特征和增殖黏附状态等），综合评价xPIB对巨噬细胞的细胞相溶性和免疫相容性。功能性实验结果表明，xPIB浸提液未影响细胞存活率，对细胞中炎症因子IL-1β，IL-6，IL-12p70，TNF-α，CD80，CD86和iNOS的表达亦无明显影响，未影响巨噬细胞的吞噬能力，表明在植入器械后，巨噬细胞依然可发挥其杀伤或清除病原微生物的功能，降低术后感染的风险。非功能性实验结果表明，黏附在xPIB表面的RAW264.7细胞处于未激活的静息状态，呈圆形，无伪足结构。因此推测，将xPIB植入动物体内，可能不会引起植入部位发生炎症反应，同时减少后囊膜浑浊的发生率［16］。此外，研究还发现，相比于生物相容性优越的疏水性丙烯酸酯，xPIB表面黏附的巨噬细胞数目显著减少，处于未活化静息状态，表明xPIB植入人眼后，在晶状体表面发生的细胞聚集、蛋白黏附、纤维增生及钙化的可能性低于疏水性丙烯酸酯。上述结果提示，xPIB具有良好的细胞相溶和免疫相容性，比医用丙烯酸酯可能有更广泛的应用前景。

与体内实验相比，体外细胞模型缺乏完整的免疫系统，仅能评价器械对单一细胞的免疫相容性，存在一定的局限性［17-18］。因此，大多数毒理学实验需要将医疗器械材料植入啮齿动物的皮下组织，进行相容性研究。但由于条件限制，本研究仅在细胞水平评价xPIB对巨噬细胞的细胞相溶和免疫相容性，仅提供参考。