黄芪提取物抑制小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的作用及机制

邢发萍，杨 柳，韩欣研，石海莲，黄 菲，吴 辉，吴晓俊

（上海中医药大学中药研究所暨上海市复方中药重点实验室，上海 201203）

多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）是一种中枢神经系统（central nervous system，CNS）自身免疫性脱髓鞘疾病，其发病可能与多种因素包括遗传、环境和病毒感染等有关［1-3］。MS的病理特征主要表现为中枢炎症、脱髓鞘、轴索丧失或损坏和胶质细胞增生等，但其发病机制目前尚未明确，普遍认为是在易感基因的基础上，受到环境因素的触发，并由CD4+T细胞介导的CNS自身免疫性疾病［4］。近年来，MS治疗药物以西药为主，有糖皮质激素、β干扰素、芬戈莫德、克拉屈滨、富马酸二甲酯等［5］。实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是目前常用于MS研究的一种经典动物模型［6］，通过免疫CNS特异性分子〔髓鞘内的少突胶质细胞表达蛋白或多肽，如髓鞘少突胶质糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG）、蛋白脂质蛋白（proteolipid protein，PLP）等〕诱导EAE，在百日咳毒素（pertussis toxin，PTX）免疫和致敏后，引起适应性免疫应答反应，导致T细胞和B细胞活化，迁移到CNS，产生神经毒性细胞因子，随后激活驻留的神经胶质细胞（小胶质细胞和星形胶质细胞）诱发CNS慢性炎症反应，并伴有脱髓鞘，轴突损伤。

黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根［7］，具有益气扶正、养阴生津、补气升阳、益卫固表、托毒生肌等作用，中医常用于治疗脾肺气虚证、气虚自汗证、气血两虚证、气血亏虚之疮疡难溃难腐或溃久难敛、痹症、卒中半身不遂、胸痹等。黄芪主要的化学成分包括多糖、皂苷和黄酮等，具有免疫调节、抗炎、抗感染、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、降血糖和双向调节血压及多种脏器保护等作用［8］。中医将MS归于痹证、痿证的范畴，治疗应以补气为主［9］。目前，临床中已有应用黄芪注射液联合甲泼尼龙治疗MS，效果显著。亦有黄芪提取物（Radix Astragalis extract，RAE）治疗EAE的相关研究，阐述了RAE对于MOG诱导的EAE小鼠T细胞增殖及炎症因子的释放具有一定的抑制作用［10］，但是否存在其他作用尚不清楚。本研究旨在EAE小鼠模型中，进一步从抗炎、抗神经细胞凋亡角度，探讨RAE对EAE的治疗作用机制，以期为RAE临床应用于MS治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药材、试剂和仪器

黄芪饮片购自上海康桥饮片公司（批号：180625）。RAE制备方法如下：取黄芪饮片1 kg，加5 L蒸馏水煮沸后，调至60～80℃，煎煮30 min，双层纱布过滤；剩余药渣加2 L蒸馏水再次煎煮30 min，双层纱布过滤；合并2次滤液，旋转蒸发浓缩，60℃水浴蒸干得到浸膏，于-70℃低温冷冻干燥成冻干粉，经计算RAE得率R=30.94%〔R=冻干粉（g）/生药（g）〕；利用紫外分光光度法以葡萄糖、芦丁、黄芪皂苷Ⅳ为标准品测定RAE中总多糖、总黄酮、总皂苷含量分别为78.02%，9.14%和0.853%。干燥粉末密封于-20℃冰箱保存备用。

小鼠髓鞘少突胶质糖蛋白35-55（myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55，MOG35-55，上海强耀生物科技有限公司，批号：9001）；弗氏完全佐剂（美国Sigma公司）；百日咳毒素（德国Merk公司）；灭活H37RA结核分枝杆菌（tuberculosis mycobacterium，TB，美国BD生物公司）；兔抗小鼠NF-κB、磷酸化NF-κB（phospho-NF-κB，p-NF-κB）、磷酸化NF-κB抑制蛋白α（phospho-IκBα，p-IκBα）、磷酸化蛋白激酶B（phospho-Akt，p-Akt）、磷脂酰肌醇三激酶（phosphatidy linositol-3-kinase，PI3K）、磷酸化磷脂酰肌醇三激酶（phospho-PI3K，p-PI3K）、Bax、Bcl-2、活化胱天蛋白酶3和GAPDH单克隆抗体（一抗）以及小鼠抗小鼠NF-κB抑制蛋白 α（NF-κB inhibitor alpha，IκBα）和蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）单克隆抗体（一抗）和辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体（二抗）（均美国CST公司）；兔抗小鼠钙离子结合衔接分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）单克隆抗体（一抗）（美国GeneTex公司）；FITC-抗小鼠CD4抗体（美国BD生物公司）；APC-抗小鼠CD11b抗体和FITC-抗小鼠CD11c抗体（美国eBioscience）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海翊圣生物科技公司）。

匀浆机（TL-48E，上海净信科技公司），水平电泳仪（Power Pac200，美国Bio-Rad公司），酶标仪（VARIOSKAN FLASH，美国Thermo公司），流式细胞仪（Guava easycyte HT，德国Millipore公司），全自动紫外与可见分析装置-凝胶成像系统（Tanon 5200，上海天能科技有限公司），制冰机（SIMF140AY65，日本Sanyo公司），高速离心机（5415R，德国Eppendorf公司）。

1.2 动物、动物分组、EAE模型制备和神经功能评分

健康雌性C57BL/6小鼠40只，5周龄，体质量15～16 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物许可证号：SCXK（沪2018-09002）。于上海中医药大学实验动物中心SPF级动物房，每笼4只，昼夜各12 h，24～26℃，相对湿度40%～60%，自由饮水摄食，适应性饲养1周后用于实验。

将小鼠随机分为5组（n=8）：正常对照组，模型组（EAE），模型+RAE 125，250和500 mg·kg-1组。RAE组于造模前2 d ig给予不同剂量RAE，每日1次，共给药23 d。正常对照组和模型组ig给予等量蒸馏水。

EAE造模方法如下：每只小鼠sc注射含H37RA TB 400 μg和MOG35-55300 μg的100 μL弗氏完全佐剂（三者混匀，涡旋乳化至白色乳浊液状，分3点背部sc注射）。造模当日，每只小鼠ip给予PTX 300 ng，隔日给予相同剂量的PTX。每日同时间给药1次并观察小鼠发病情况，同时采用双盲法记录神经功能评分及体质量变化。神经功能评分标准如下［11］：0分，无发病迹象；0.5分，尾尖点地；1分，尾部下垂或轻度步履蹒跚；1.5分，尾巴完全拖地，步态不稳；2分，双后肢无力，或一肢瘫痪，被动翻身后可恢复；3分，双后肢瘫痪，被动翻身后不可恢复，但给予刺激后可挪动；4分，双后肢瘫痪，前肢瘫痪或肌力减弱伴尿便失禁；5分，死亡。

1.3 样本收集和组织病理评分

造模第21天取各组小鼠5只ip给予1%戊巴比妥钠麻醉，冰上取小鼠脊髓组织于灭菌EP管中，液氮速冻后-80℃冰箱保存。取脾组织于灭菌PBS中，分离脾细胞用于后续流式检测CD4+、CD11b+、CD11c+细胞百分比。另取每组小鼠3只，4%多聚甲醛心脏灌流，取脊髓，于4%多聚甲醛中4℃固定2 d，蔗糖梯度脱水后分别进行HE染色和劳克坚劳蓝（luxol fast blue，LFB）染色。光镜下观察组织病理变化并进行评分［12］①HE评分标准：0分，无炎症细胞；1分，少量炎症细胞；2分，血管周围组织浸润；3分，大量炎性浸润。②LFB评分标准：0分，无脱髓鞘；1分，罕见脱髓鞘；2分，少数脱髓鞘；3分，大面积脱髓鞘。

1.4 流式细胞法测定脾组织CD4+，CD11b+和CD11c+细胞百分比

分离脾细胞后调整细胞密度为2×1010L-1，而后将样品平均分为3份，每管50 μL细胞悬液，进行流式染色。方法如下：每个样品加染色缓冲液（PBS+2%胎牛血清）1 mL，吹打混匀后离心（4℃，159×g，5 min）弃上清，按抗体说明书推荐量，室温下分别加FITC-抗小鼠CD4抗体、APC-抗小鼠CD11b抗体、FITC-抗小鼠CD11c抗体，4℃孵育30 min，后加染色缓冲液1 mL吹打混匀后离心（4℃，159×g，5 min）弃上清，重复2次后，加染色缓冲液650 μL重悬细胞，96孔板每个样品设3复孔，每孔加200 μL细胞悬液，流式细胞仪检测各阳性细胞百分比。

1.5 Western印迹法测定脊髓组织NF- κB信号通路、Pl3K/Akt信号通路蛋白及凋亡相关蛋白表达水平

从-80℃冰箱取出脊髓样品，每个样品加300 μL蛋白裂解液，匀浆后离心（4℃，13 523×g，15 min），吸取上清液。BCA试剂盒测定蛋白浓度后，取30 μg样品上样，10%SDS-PAGE电泳分离后转至PDVF膜。5%脱脂奶粉封闭1.5 h，加一抗（1∶1000）4℃孵育过夜；次日，PBST洗涤3次（每次10 min）后，加二抗（1∶5000）室温孵育1 h，PBST洗涤3次（每次10 min）；最后，用ECL显色试剂盒进行显色。运用TanonImage分析蛋白条带积分吸光度，以目标蛋白与内参蛋白积分吸光度比值表示其相对表达水平。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 黄芪提取物对EAE模型小鼠临床评分及体质量的影响

Fig.1 Effect of Radix Astragali extract（RAE）on clinical score and body mass of experimental autoimmune encephalomyelitis（EAE）model mice.EAE model was induced by sc injection of myelin oligodendrocyte glycoprotein（MOG35-55）emulsified in compelete Freund adjuvant with H37RA Mycobacterium Tuberculosis.Meanwhile，Pertussis toxin（PTX）was ip given immediately and again 48 h later.RAE was ig administered two days prior to immunization and continued for 23 d.Mice were monitored daily for clinical score and body mass.A：changes in clinical scores；B：changes in body mass；C：mean clinical scores from the 12th-21stday.D：mean body mass at the 1st，2ndand 3rdweeks.x± s，n=8. ＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

神经功能评分及体质量变化结果（图1）显示，与正常对照组相比，EAE模型组在造模第12天起开始相继发病，可见小鼠精神萎靡，饮食活动减少，并逐渐出现神经功能损伤症状，表现为尾尖拖地或全尾瘫痪，步履蹒跚，单侧或双侧后肢瘫痪，前肢瘫痪甚至全身瘫痪，在给药第1，2和3周小鼠的平均体质量与正常对照组相比显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。与EAE模型组相比，RAE各给药组在给药第12～21天平均临床评分显著低于EAE组平均临床评分（P＜0.05，P＜0.01），给药第1，2和3周模型+RAE 500 mg·kg-1组的平均体质量显著高于EAE模型组（P＜0.05，P＜0.01），给药第3周模型+RAE 125 mg·kg-1组的平均体质量显著高于EAE模型组（P＜0.01），提示黄芪提取物可有效降低EAE小鼠的临床评分，减少小鼠体质量的降低。

2.2 黄芪提取物对EAE模型小鼠脊髓组织病理变化的影响

Fig.2 Effect of RAE on inflammatory infiltration and demyelination of spinal cord in EAE mice.See Fig.1 for the mouse treatment.A：HE and Luxol fast blue（LFB）staining，the arrows show infiltration of inflammatory cells and the areas of demyelination in the parenchymal tissues of spinal cords；B：pathological score based on the HE and LFB staining.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

HE染色和LFB染色及病理评分结果（图2）显示，与正常对照组相比，EAE模型组脊髓组织白质区有大量炎症细胞浸润及大面积的髓鞘脱失，与此相对应，其病理学评分显著高于对照（P＜0.01）。与EAE模型组相比，模型+RAE 125 mg·kg-1组基本无炎症浸润及脱髓鞘情况（P＜0.01）。模型+RAE 250和500 mg·kg-1组均有少量炎症细胞浸润和脱髓鞘，但与EAE模型组相比明显得到改善（P＜0.05），提示RAE给药可改善EAE小鼠脊髓组织炎症细胞浸润及脱髓鞘现象。

2.3 黄芪提取物对EAE模型小鼠脾CD4+，CD11b+和CD11c+细胞百分比的影响

Fig.3 Effect of RAE on percentages of CD4+，CD11b+and CD11c+cells in spleen of EAE model mice.See Fig.1 for the mouse treatment.A：flow cytometry assay of CD4+，CD11b+and CD11c+cells；B：percentages of CD4+，CD11b+and CD11c+cells.±s，n=5.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；##P＜0.01，compared with model group.

流式检测结果（图3）显示，与正常对照组相比，EAE 模型组脾CD4+，CD11b+和 CD11c+细胞百分比均增加（P＜0.01）。与模型组相比，RAE各组均可降低脾CD4+，CD11b+和CD11c+细胞百分比（P＜0.01），提示RAE对外周免疫细胞具有一定的调节作用。

2.4 黄芪提取物对EAE模型小鼠脊髓组织NF- κB和Pl3K/Akt信号通路相关蛋白及Bax，Bcl-2，活化胱天蛋白酶3和lba1蛋白表达的影响

Fig.4 Effect of RAE on expression of NF- κB，phosphatidylinositide 3-OH kinase/protein kinase B（Pl3K/Akt） signaling pathway related proteins and Bax，Bcl-2，cleaved-caspase 3 and ionized calcium binding adapter molecule 1（lba1）proteins in spinal cord of EAE model mice by Western blotting.See Fig.1 for the mouse treatment.IA：integrated absorbance.C was the semiquantatitive results of A and B.±s，n=4.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜ 0.05，##P＜0.01，compared with model group.

Western印迹结果（图4）显示，与正常对照组相比，模型组NF-κB信号通路蛋白NF-κB和IκBα磷酸化水平及Iba1、Bax和活化胱天蛋白酶3等蛋白表达水平均显著增加（P＜0.01），而PI3K/Akt信号通路蛋白PI3K和Akt磷酸化水平及Bcl-2/Bax蛋白表达比值显著降低（P＜0.01）。与模型组相比，RAE 125 mg·kg-1对上述蛋白表达的变化均可明显逆转（P＜0.05，P＜0.01），RAE 250可显著降低p-IκBα/IκBα 和 Bcl-2/Bax的蛋白表达比值（P＜0.05）；RAE 500 mg·kg-1可显著降低p-Akt/Akt的蛋白表达比值。

3 讨论

本研究结果显示，与EAE模型组相比，RAE各给药组的临床评分显著降低，脊髓组织炎症细胞浸润和髓鞘脱失也显著减少，尤其是模型+RAE 125 mg·kg-1组基本无炎症细胞浸润和髓鞘脱失的现象，提示RAE可有效改善EAE小鼠的临床症状，抑制EAE小鼠的神经损伤。

CD4+T细胞在MS发病机制中占有核心地位［13］。在被抗原提呈细胞激活后，CD4+T细胞通过血脑屏障进入CNS，与靶抗原结合，分泌促炎症细胞因子，进而激活小胶质细胞和巨噬细胞，扩大CNS炎症反应，使补体激活或释放蛋白水解酶和脂解酶，最终导致髓鞘破坏，轴索损失。CD11b和CD11c为Ⅰ型跨膜糖蛋白，两者均参与并间接活CD4+T细胞从而调控免疫应答的发生［14］。CD11b高表达于巨噬细胞表面，主要用于标记巨噬细胞，在MS中巨噬细胞激活后将会分泌大量促炎细胞因子，诱导炎症反应从而导致斑块状脱髓鞘和轴索损伤［15］。CD11c主要用于标记树突状细胞（dendritic cells，DC），在MS中DC细胞的主要功能是获取并加工抗原，上调协同刺激分子，随后将抗原提呈给初始T细胞，从而激活免疫反应［16］。本研究结果显示，EAE模型小鼠脾CD4+，CD11b+，CD11c+细胞百分比显著上调，RAE可显著抑制CD4+T细胞、CD11c+DC细胞和CD11b+巨噬细胞的百分比，提示RAE可能通过抑制外周免疫细胞的激活，从而抑制炎症反应。

小胶质细胞是CNS中的一种巨噬细胞，在免疫防御体系中扮演了极其重要的角色。病理状态下，异常激活的小胶质细胞产生大量的炎症因子和介质，进一步促进炎症反应的发展和小胶质细胞的增殖，引发炎症的联级反应造成神经毒性，Iba1为小胶质细胞激活的标志物［17-18］。NF-κB在神经炎症性疾病进程中扮演重要的角色。目前普遍认为，胶质细胞的激活，血脑屏障的破坏及外周免疫细胞进入脑实质都是神经炎症的表现，过度的神经炎症反应将会加重神经系统的退行性病变。本研究结果显示，EAE模型小鼠CNS NF-κB信号通路蛋白磷酸化水平和Iba1蛋白表达显著上调，RAE 125 mg·kg-1可显著下调该模型小鼠脊髓组织NF-κB信号通路蛋白磷酸化水平和Iba1蛋白的表达，提示RAE可能通过抑制NF-κB信号通路和小胶质细胞的激活，从而抑制CNS的过度炎症反应。

PI3K/Akt信号通路是一条重要的细胞存活信号通路，参与调节许多细胞凋亡的过程。Akt是原癌基因c-akt的表达产物，它的激活受PI3K调控，为神经元存活、神经新生、轴突以及树突形成、突触结构形成和突触间信息传递所必需［19］。PI3K/Akt信号通路激活可抑制线粒体Bcl-2家族相关蛋白（Bax和Bad）表达，减少细胞色素c细胞浆释放，阻滞其结合细胞质中的凋亡蛋白激活因子，减弱胱天蛋白酶级联反应，从而抑制因线粒体功能及结构发生障碍导致的细胞凋亡。线粒体完整性受Bcl-2家族蛋白调控，包括蛋白Bcl-2，Bax等。Bax是重要促细胞凋亡基因，Bcl-2是关键抑制凋亡基因，而Bax/Bcl-2比例具有决定细胞凋亡强弱的作用。胱天蛋白酶3是胱天蛋白酶家族在凋亡过程中重要的蛋白酶，是多种凋亡途径的共同下游效应因子，可直接诱导神经细胞凋亡［20］。本研究结果显示，RAE 125 mg·kg-1可显著上调EAE小鼠脊髓组织PI3K/Akt信号通路蛋白磷酸化水平，显著下调促凋亡蛋白Bax和活化胱天蛋白酶3的表达，Bcl-2/Bax的比值也显著增加，提示RAE可能通过促进PI3K/Akt信号通路的激活、抑制神经细胞的凋亡从而达到一定的神经保护作用。

由于RAE中主要的化学成分为黄芪多糖，既有免疫增强作用，同时也存在免疫抑制作用，能双向调节免疫系统的功能［21］。本研究结果发现，RAE 125 mg·kg-1对EAE模型小鼠神经炎症的改善作用似乎优于RAE 250和500 mg·kg-1，可能是由于RAE中黄芪多糖成分含量较高，对免疫系统具有双向调节的作用所致，具体原因需进一步探讨。

综上所述，RAE可有效缓解EAE模型小鼠的发病症状，减少CNS的炎症浸润和脱髓鞘，其作用机制可能与降低周边炎症细胞激活、抑制CNS神经炎症及减少神经细胞的凋亡相关。