实验性自身免疫性神经炎大鼠模型的制备与评价

张明　原晓晶　敖强

[摘要] 目的 探索实验性自身免疫性神经炎（EAN）动物模型的建立和相关指标的评价。 方法 将20只体重140～160 g的 Lewis雌性大鼠随机分为EAN组（n = 10）和对照组（n = 10），并对各组从1～10进行编号。EAN组采用P0180-199多肽免疫，对照组注射生理盐水；免疫后观察42 d，记录行为学变化并评分；免疫后第18天检测两组大鼠神经肌肉动作电位、坐骨神经电镜组织学及免疫组织化学、腓肠肌HE染色等指标。 结果 EAN组高峰期坐骨神经复合动作电位传导速度低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），振幅明显低于对照组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。电镜结果显示EAN组大鼠坐骨神经髓鞘结构肿胀、蜂窝改变、脱失，轴突变细或消失。HE染色结果显示EAN組大鼠腓肠肌纤维变细、胞浆淡染等炎症退行性改变。免疫组化结果显示坐骨神经髓鞘结构以水肿、脱失为主者炎症因子Iba-1（巨噬细胞）、CD3（T 细胞）增多；坐骨神经髓鞘结构以脱失为主者神经轴蛋白NF200减少；坐骨神经髓鞘结构以蜂窝状改变、脱失为主者神经髓鞘蛋白S100减少。 结论 采用P0180-199诱导的自身免疫性神经炎模型发病率高，容易复制，病理改变接近临床特发性神经炎。本研究EAN发病高峰期的各项评价指标为该模型进一步的病生理过程探讨提供了依据。

[关键词] 实验性自身免疫性神经炎；模型；脱髓鞘

[中图分类号] R745.430.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）05（c）-0026-05

[Abstract] Objective To explore the establishment of experimental autoimmune neuritis （EAN） rat model and the evaluation of related indexes. Methods Twenty female Lewis rats weighing 140-160 g were randomly divided into EAN group （n = 10） and control group （n = 10）， and the number of each group was 1-10. The EAN group was immunized with P0180-199 peptide. The control group was injected with saline. After 42 days of immunization， the behavioral changes were recorded and scored. At the eighteenth days after immunization， the nerve-muscle action potential， sciatic nerve electronic microscope and immunohistochemistry and HE staining of gastrocnemius muscle and other indicators of the rats in the two groups were detected. Results The sciatic nerve conduction velocity in the peak of the compound action potential in the EAN group was lower than that of control group， with statistically significant difference （P < 0.05）， and the amplitude was obviously lower than that of control group， with highly statistically significant difference （P < 0.01）. The results of electron-microscope showed swell， honeycomb changes and miss out of myelin sheath， with an attenuation or disappearance of axon in the EAN group. The results of HE staining showed thinning of gastrocnemius-myofibers and stained cytoplasm and other degenerative changes in the EAN group. The results of immunohistochemistry showed that inflammatory factors Iba-1 （macrophage） and CD3 （T cells） were increased in those with swell and miss out of myelin sheath. The axonal protein NF 200 was decreased in those with miss out of myelin sheath. The myelin protein S100 was decreased in those with honeycomb changes and miss out of myelin sheath. Conclusion The autoimmune neuritis model induced by the P0180-199 has high incidence and easy copy， and the pathological changes are close to clinical idiopathic neuritis. In this study， the evaluation indexes of EAN during peak hours provide a basis for the further study of the physiological process of this disease.

[Key words] Experimental autoimmune neuritis； Model； Demyelination

实验性自身免疫性神经炎（experimental autoimmune neuritis，EAN）是国际上公认的吉兰-巴雷综合征（Guillian-Barre syndrome，GBS）的经典动物模型，该动物模型的建立对GBS自身免疫性机制的假说起到了很大的支持作用[1-4]。Waksman等在1955年首次使用周围神经匀浆在兔子身上建立了人类GBS模型[5]。其后，研究者们通过纯化的外周神经组织匀浆、髓鞘蛋白或合成多肽，来诱导各种易感动物模型，也有研究者将具有抗原特异性T细胞系静脉注入动物体内，来诱导具有抗原特性的EAN模型[6-7]，其中最为广泛应用的是通过外周神经匀浆、髓鞘蛋白或合成多肽诱导的Lewis大鼠模型，例如采用P0180-199配以不完全弗氏佐剂免疫[8-9]。EAN典型病理表现是T细胞和巨噬细胞浸润，外周神经组织水肿及脱髓鞘[10-12]，坐骨神经及腰髓神经根病理改变最明显，而颈丛神经及颈髓神经根则不明显[7]。1975年Allt[13]通过电镜对兔EAN模型外周神经进行观察，发现了髓鞘的两种变化：髓鞘蜂窝改变和髓鞘脱失。对于坐骨神经组织水肿的病理改变，Izumo等[14]曾通过神经内膜的白蛋白和纤维蛋白原免疫组化的检测予以证实，但没有更进一步细致的研究。本研究观察Lewis雌性大鼠EAN模型行为学、外周神经电生理、组织病理学等各方面的变化，并重点研究外周神经超微结构变化及分类，探讨其与炎症因子、髓鞘蛋白、轴突蛋白间的联系，进而探讨疾病形成机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

由于自身免疫性神经炎是一种短时程自限性疾病，雌性Lewis大鼠性情比较温顺，对于给药注射免疫应急反应良好，所以采用健康纯系雌性Lewis大鼠20只，6～8周龄，体重140～160 g，并委托清华大学动物平台购自北京维通利华（Vital River）公司[合格证号：SCXK（京）2014-0007]，昼夜12 h交替光照，自由摄食饮水，在室温（20±2）℃条件下饲养，隔日更换垫料。实验过程由清华大学动物伦理委员会审核通过。

1.2 仪器与试药

P0180-199（SSKRGRQTPVLYAMLDHSRS）多肽购自安徽瀚海博兴生物技术有限公司；不完全氟氏佐剂（Incomplete Freund's Adjuvant，IFA）购自美国Sigma公司；结核分枝杆菌（H37Ra）购自美国DIfco公司。台式离心机（5424）购自Eppendorf公司；电生理仪（RM-6240BD/CD生物信号采集处理系统2.02版）购自成都仪器厂；透射电子显微镜（JEM-1200EX）购自NIKON公司（日本）；激光共聚焦显微镜（FV10i-oil）购自Olympus公司（日本）。

1.3 造模与分组

健康纯系Lewis雌性大鼠20只，按随机数字表随机分成两组，每组10只，EAN组（P0180-199），对照组（生理盐水）。将200 μg P0180-199、1 mg H37Ra、100 μL生理盐水、100 μL IFA混合液充分乳化，作为一只大鼠的注射用量，注射入双后肢足底皮下（每只足底100 μL）。对照组注射生理盐水100 μL。老鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，然后在两侧脚掌部位用1 mL注射器分别打入100 μL以上混合好的造模试剂和对照组等量的生理盐水。造模成功的标准主要看大鼠形态学上的变化，足底发红肿胀，严重时出现溃疡，尾巴下垂甚至拖地，后肢对于外界刺进反应迟缓等因素结合考虑。

1.4 临床评分

免疫当天即第0天开始每天对两组大鼠进行称重、行为学评分记录，一直到免疫第42天时结束。评分标准，正常：0分；尾巴拖地或尾尖上翘：1分；翻正反射受损：2分；中度瘫痪：3分；重度瘫痪：4分；四肢瘫痪或死亡：5分[8]。症状介于中间时评分值±0.5分。

1.5 神经电生理

免疫第18天时每组大鼠各取5只，称重，腹腔注射1%戊巴比妥钠按照3 mg/100 g，进行麻醉，放置刺激电极、无关电极及记录电极。采用电生理仪检测并记录神经-肌肉动作电位（compound muscle action potentials，CMAPs）。将检测数据代入公式：CCV（m/s）=刺激电极与记录电极间的距离/传导时间，计算測定部位的MNCV。

1.6 组织学观察

免疫第18天时取大鼠腓肠肌标本，进行HE染色：冰冻切片固定15～30 s，稍水洗3～5 s；苏木精液染色（60℃）8 min；流水洗去苏木精液5 min；1%盐酸乙醇5～10 s，流水冲洗30 s；促蓝液返蓝5～10 s，流水冲洗15～30 s；伊红染色50 s，蒸馏水稍洗4～6 s；脱水，透明，中性树胶封固，光镜观察。

1.7 透射电镜观察神经超微结构

免疫第18天时电生理检测后处死大鼠，避开刺激电极接触部位，双侧坐骨神经各取1 cm长神经，并固定于2.5%戊二醛中。PBS冲洗后经系列脱水，无水乙醇，15 min，95%丙酮15 min；无水丙酮10 min，5 min换液1次。包埋：将组织放入包埋剂氧化丙烯（1∶1）溶液中1 h，纯包埋剂中3 h。超薄切片后用醋酸双氧铀及柠檬酸铅双重染色。透射电子显微镜观察、摄片。

1.8 免疫组织化学

免疫第18天时从大鼠坐骨神经根部取约1 cm长神经做免疫组化。免疫组织化学染色标记大鼠坐骨神经CD3（T细胞）、Iba-1（巨噬细胞）、S100（雪旺细胞）、NF200（轴突细胞）。免疫荧光染色后用激光共聚焦显微镜分析照相。

1.9 统计学方法

運用SPSS 17.0软件进行数据处理，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用两独立样本t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型鼠发病及评分情况

EAN组大鼠从免疫第1天开始出现不同程度的临床症状，包括精神不振、皮毛不洁、双后足红肿、体重下降等，免疫第7天时两组所有大鼠均出现尾巴拖地行为，即行为学评分1分，提示造模成功。第16～17天瘫痪达到高峰，第18天后逐渐缓解，高峰持续约10 d，随后临床评分有所下降。EAN组和对照组临床评分结果见图1。

2.2 神经电生理结果

EAN组坐骨神经传导速度为（19.69±4.47）m/s，低于对照组[（30.98±2.71）m/s]，差异有统计学意义（P < 0.05）；EAN组坐骨神经动作电位振幅为（2.12±0.83）mV，明显低于对照组[（12.18±1.71）mV]，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见图2。

2.3 组织学观察结果

对照组大鼠腓肠肌表现为胞膜完整，胞质染色均匀，胞核位于细胞边缘，肌纤维间的空隙较小。EAN组大鼠腓肠肌可见胞膜不完整，胞质染色变浅且不均匀，胞核位于细胞中央甚至消失，肌纤维变细、排列杂乱，空隙增大。见图3。

2.4 电镜结果

对照组：神经纤维髓鞘和轴索结构正常，圆心轴索周围有层状髓鞘板层结构包饶。EAN组：髓鞘板层肿胀；蜂窝状改变；髓鞘剥脱。见图4～5。

2.5 免疫荧光化学结果

对照组：髓鞘紧密包饶在轴突外层，轴突结构明显，有散在的炎症因子。EAN组：①髓鞘肿胀。髓鞘结构变粗，有较多炎症因子。②髓鞘剥脱。髓鞘结构明显减少；轴突变细、减少，有较多炎性因子。③髓鞘蜂窝状改变。髓鞘结构呈蜂窝状，炎症因子明显少。见图6～8（封三、封四）。

3 讨论

本研究采用大鼠进行模型试验，相对于家兔实验容易操作，给药剂量容易把控，在模型建立成功的基础上家兔对于疾病的耐受较差，容易导致死亡。评价方法方面大鼠在对于变态反应性方面更加明显，拖尾程度也是重要的参考标准之一。本研究使用P0180-199诱导Lewis雌性大鼠成功的造模，对以往文献中使用P0180-199造模的过程加以验证[8，15]。采用单盲法观察，六级评分法作为评分标准[16-17]。EAN组大鼠免疫第1天开始出现不同程度的临床症状，包括精神不振、皮毛不洁、双后足红肿、体重下降等，类似于GBS发病前的病毒感染症状[18]，与免疫原引起全身免疫反应有关；免疫第7天时两组大鼠均出现尾巴拖地行为，即行为学评分1分，提示造模成功。第16～17天瘫痪达到高峰，第18天后逐渐缓解，高峰持续约10 d，随后临床评分有所下降。

电生理检测结果显示，与对照组相比，EAN组坐骨神经传导速度减慢，振幅也明显降低，差异有统计学意义。传导速度反映的是传导最快神经纤维的速度[19]，与神经轴数量无关，间接反映了神经脱髓鞘的病变程度。振幅主要与轴突数量有关，数量越多，振幅就越高[20]。

HE染色结果显示，EAN组腓肠肌可见胞膜不完整，胞质染色变浅且不均匀，胞核位于细胞中央甚至消失，肌纤维变细，排列杂乱，空隙增大，而临床症状表现为后肢肿胀，溃烂，不能自力行走，或拖着后肢缓慢行走，运动量显著降低，说明在运动减少后肌肉出现明显的退行性改变，因为运动功能障碍运动量减少可能引起肌肉的废用性萎缩[21]。

透射电镜神经超微结构结果显示，在EAN组大鼠症状达到高峰期时出现了四种病理结果： 髓鞘肿胀；髓鞘剥脱；髓鞘蜂窝状改变；轴突变细或消失，对Allt[13]电镜病理结果进行了补充和完善。虽然有关于通过免疫组织化学观察到EAN模型髓鞘肿胀的报道[14]，但目前尚未见到使用电镜观察到这种病理现象的相关报道。免疫组化结果显示，炎症因子Iba-1和 CD3在髓鞘肿胀中表达最多，髓鞘剥脱中次之，而在蜂窝状改变中的表达量最少，接近正常，说明髓鞘肿胀、剥脱与免疫反应中T细胞和巨噬细胞的攻击有密切关系，而髓鞘蜂窝状的改变与之关系不大。这对EAN神经病理生理的进一步研究有促进作用。

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（收稿日期：2017-02-04 本文編辑：张瑜杰）