甘蔗尾中乳酸菌的分离筛选和鉴定

郭艳霞，杨承剑，彭开屏，唐庆凤，唐振华，梁 辛，李孟伟，李丽莉

（中国农业科学院 广西水牛研究所，广西 南宁 530001）

广西是我国最大的甘蔗(Saccharum sinense)种植省区，据报道，2016年广西甘蔗种植面积达108.15万 hm2，产量占全国甘蔗总产量的60%[1]。据联合国粮食及农业组织(FAO)数据库可得，2016年中国甘蔗总产量约为12 306万 t[2]。甘蔗尾是甘蔗的副产品，指甘蔗顶上2～3个嫩节和其附带的整个青绿色叶片，大约占蔗茎重的12%～20%[3]，产量巨大。甘蔗尾的营养成分全面，含糖量高，适口性好，通常作为水牛饲喂的主要青绿饲料来源之一。但是甘蔗的收获具有季节性和集中性，加上广西地区炎热潮湿，甘蔗很容易腐败发霉，导致了资源的浪费，甘蔗尾饲料化的利用率还不到20%[4]。前人研究报道[5-7]，利用特定的菌类使甘蔗尾发酵，不仅可以延长甘蔗尾的保存期，而且可以改善其营养价值和提高饲料利用率。甘蔗尾自然发酵过程主要由乳酸菌利用厌氧环境，迅速生长产生大量的乳酸和乙酸，从而抑制霉菌等腐败菌的生长。但是，青贮饲料的发酵品质受到饲料表面附着的乳酸菌数量、活性和多样性的影响[8]。目前，研究多集中于传统发酵食品中乳酸菌的分离与鉴定[9-10]，而对于饲草上附着的乳酸菌或是青贮饲料中的乳酸菌的分离筛选鉴定研究报道较少。Pang等[11]对青藏高原地区的玉米(Zea mays)、苜蓿(Medicago sativa)、三叶草(Trifolium scabrum)、红豆草(Onobrychis viciifolia)和印度鹅耳草(Eleusine indica)5种主要牧草上自然附着的乳酸菌进行了分离鉴定，分离出140株乳酸菌，经鉴定为5个属9个种。而对打包自然发酵的甘蔗尾中附着乳酸菌的研究还尚未见报道。本研究对打包自然发酵甘蔗尾中的乳酸菌进行分离，测定生物学特性和产酸能力，以期筛选出适合甘蔗尾青贮用的乳酸菌菌株，为新型青贮乳酸菌接种剂的研发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘蔗尾样品：新鲜甘蔗尾采自广西武鸣县甘蔗种植户，进行揉搓后打包青贮，每袋约60 kg，分别于第0、15、30、45、60和90天采样分离。

MRS肉汤琼脂培养基、MRS肉汤培养基(121 ℃，15 min灭菌)购自杭州滨和微生物试剂有限公司，液体石蜡、丙三醇等购自天津市富宇精细化工有限公司，碳水化合物鉴定试剂条API 50 CH、API 50 CHL培养基购自梅里埃诊断产品(上海)有限公司，Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-1F型超净工作台购自苏州苏洁净化设备有限公司，GI036T型立式自动压力蒸汽灭菌锅购自厦门致微有限公司，XMTE-8112型电热恒温水浴锅，XMTD-8222型恒温培养箱购自上海精宏实验设备有限公司，HANNA HI 8424 pH 测定仪购自北京欧信胜科技有限公司，THZ-82A 恒温振荡器购自常州国华电器有限公司，ECLIPSE 50i正置生物显微镜购自Nikon日本公司。

1.3 试验方法

1.3.1 甘蔗尾上乳酸菌的分离和纯化

打包青贮的甘蔗尾在第0、15、30、45、60和90天分别取样，各3个重复。取混合均匀的甘蔗尾样品10 g加入到90 mL无菌生理盐水中，在涡旋仪上充分混匀，用无菌生理盐水稀释成浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-66 个梯度的样液，每个梯度3个平行。分别取各稀释度样液200 μL，用接种环均匀涂布于MRS固体培养基上，于37 ℃培养48 h。挑取肉眼可见、生长较快的单个典型菌落，在MRS固体培养基上划线培养，经过多次分离纯化，直至革兰氏染色镜检为单一形态紫色细胞，即得到纯化的单一菌株。取单一菌落接种于MRS液体培养基中，在37 ℃富集培养24 h，进行编号，加同体积的40%甘油保存于-20 ℃备用。

1.3.2 乳酸菌 API 50 CH 生化试剂盒鉴定

鉴定原理：API 50 CHL主要用于乳酸杆菌和相关菌的鉴定，试剂盒是有由49种可以发酵的碳水化合物的API 50 CH试剂条组成。当试剂条接种菌液培养时，由于菌种可利用某些碳水化合物产酸，使发酵液pH下降，指示剂变色。结果对照反应鉴定表或apiweb鉴定软件。

具体操作步骤按照说明书进行。

1.3.3 乳酸菌菌株的16S rDNA序列分析及系统进化树的构建

使用生工Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒，对菌株培养液进行DNA提取，具体操作步骤参照产品说明书。将提取的乳酸菌基因组DNA送往上海生工生物有限公司进行测序，将测序结果拼接后输入GenBank数据库，运用BLAST程序将测序结果与NCBI核酸数据库中的公开序列进行比对(http://blast.Ncbi.nlm.nih.gov/Blast)，选取GenBank中相似性最高的已知序列构建系统发育树，再用MEGA4.0软件采用Neighbor-Joining方法构建系统发育树。

1.3.4 乳酸菌产酸能力测定

挑选分离鉴定出的菌株进行产酸能力测定，将保存的菌株先活化，然后将活化好的菌株以5%的接种量接种到MRS液体培养基里，放入恒温培养箱，37 ℃，培养18 h，然后测定发酵菌液的pH。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的形态学特性

从0-90 d打包青贮的甘蔗尾样品中共分离得到的291株乳酸菌菌株，通过生长产酸试验，得到产酸能力较强的20株乳酸菌，此20株乳酸菌均分离于青贮第0天(青贮当天)，分别编号为Y4、Y12、 Y18、 Y23、 Y24、 Y26、 Y32、 Y33、 Y37、Y40、 Y42、 Y44、 Y45、 Y46、 Y55、 Y56、 Y59、Y61、Y64、Y67。划线接种于MRS固体培养基上，培养48 h后，所有的菌株菌落形态和革兰氏染色镜检细胞形态结果如图1和图2所示。

图1 乳酸菌菌落形态Figure 1 Colony morphology of lactic acid bacteria strains

图2 乳酸菌的细胞形态Figure 2 Cell morphology of lactic acid bacteria

MRS固体培养基上有单个菌落出现，菌落较小，所有菌落均呈现圆形，乳白色，表面光滑细密，边缘整齐，中央微凸起(图1)。菌株呈短杆状，单个、成对或短链状存在，无芽孢，革兰氏染色为紫色，均为阳性菌(图2)。经形态学检查可初步鉴定为乳酸杆菌。

2.2 乳酸菌API 50 CH生化试剂盒鉴定结果

从0-90 d打包青贮的甘蔗尾样品中分离得到乳酸菌菌株20株，培养48 h后，采用乳酸菌API 50 CH 生化试剂盒分析碳水化合物的发酵结果 (表1)。根据API细菌鉴定金标准中API 50 CH反应鉴定表(在孵育48 h后阳性反应率)，可初步鉴定出，菌株Y42是L. casei(干酪乳杆菌)，Y32、Y59是L. paracasei(副干酪乳杆菌)，其余的17株是L. plantarum(植物乳酸杆菌)。为了更好地确定菌株的种属，可进一步做16S rDNA基因序列分析。

2.3 乳酸菌菌株的16S rDNA序列分析鉴定结果

将分离的20株乳酸菌菌株16S rDNA扩增产物测序结果同NCBI数据库进行BLAST相似性对比分析(表2)。根据BLAST的比对结果，下载最相似的已知菌株序列，然后运用BioEdit、Clustalx1.83和Mega4等软件，以大肠杆菌(Escherichia coli)(NCBI登录号：X80725)为外群构建系统发育树(图3)。

分离的20株乳酸菌菌株经PCR扩增所或得的16S rDNA 基因部分序列长度为 1 461～1 466 bp。16S rDNA序列Blast比对结果表明，20株乳酸菌菌株的16S rDNA基因序列与近缘种基因序列相似度可达到99%～100%(表2)。根据系统发育树可得(图3)，乳酸菌菌株位于不同的两大分支，Y32、Y59和Y42聚为一枝，自展支持率达到77%，结合碳源发酵结果和与近缘种基因序列相似度可达到99%，可将Y42鉴定为L. casei(干酪乳杆菌)，将Y32、Y59鉴定为L. paracasei(副干酪乳杆菌)。其余的17株乳酸菌菌株聚为一枝，自展支持率为92%，说明他们之间有很近的亲缘关系，结合碳源发酵结果和 BLAST 相似性对比结果(表2)，可鉴定为L. plantarum(植物乳酸杆菌)。

2.4 乳酸菌产酸能力测定

将分离鉴定出来的20株乳酸菌菌株以5%的接种量接种到MRS液体培养基，在37 ℃条件下，培养18 h后，摇匀测定菌株发酵液的pH，结果显示，这20株乳酸菌菌株发酵液pH均在3.70以下，Y67菌株发酵液的pH最低，达到3.57，其次是Y44，菌株发酵液pH是3.59(表3)。发酵液pH最高是菌株Y26和Y18，pH是3.69。说明分离的20株乳酸菌菌株均表现出很好的产酸能力。

表1 甘蔗尾乳酸菌API 50 CH碳源发酵结果Table 1 API 50 CH fermentation patterns of lactic acid bacteria strains isolated from sugarcane sheaths

续表 1Table 1 (Continued)

表2 乳酸菌菌株16S rDNA序列Blast比对结果Table 2 BLAST results of 16S rDNA sequences of lactic acid bacteria strains

3 讨论

饲草青贮过程是多种微生物共同作用的过程，主要是饲草表面上附着的乳酸菌，在青贮过程中起着关键性的作用。在青贮发酵过程中，随着厌氧和酸性环境的形成，乳酸菌数量迅速增加，发酵体系的pH也逐渐降低，抑制了大部分好氧细菌、大肠杆菌和霉菌等不利于青贮发酵的微生物的繁殖[12]，使发酵效果更理想。因此，从青贮饲料中分离筛选出青贮用优良乳酸菌，对饲草青贮发酵具有重要的意义。对分离的细菌进行鉴定的方法除了传统的形态学鉴定和生理生化特征鉴定外，分子生物学鉴定是必不可少的方法[13]。在细菌基因组中，编码16S rRNA的rDNA基因具有良好的进化保守性，保守序列区域反映了生物物种间的亲缘关系，而高变序列区域则能体现物种间的差异[14]。16S rDNA基因序列分析方法可作为乳酸菌种属鉴定最常用的分子学鉴定方法[15-16]。

图3 乳酸菌16S rDNA序列系统发育树Figure 3 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequence of lactic acid bacteria strains

本研究中从打包青贮的甘蔗尾中分离出了20株乳酸菌菌株，通过传统的菌落和细菌形态学检查和碳源发酵特性对分离乳酸菌菌株做了初步鉴定，然后通过16S rDNA基因序列分析方法对传统鉴定方法进一步验证，鉴定出了Y42是干酪乳杆菌、Y32和Y59是副干酪乳杆菌，其余17株是植物乳杆菌。也有大量研究表明，这些乳酸菌菌株在饲料和食品发酵行业也是优势菌株。杨承剑等[17]从自然堆放发酵的木薯(Manihot esculenta)渣中分离鉴定出了3株干酪乳杆菌、3株植物乳杆菌、1株丘状乳杆菌、1株副干酪乳杆菌和1株类布氏乳杆菌，其中植物乳杆菌和干酪乳杆菌的产酸能力最强，皆可用于木薯渣堆放的发酵。崔棹茗等[18]经传统微生物鉴定方法和16S rDNA基因序列分析法 ， 从 青 藏 高 原 青 稞 (Hordeum vulgare var. nudum)秸秆青贮饲料中分离出了1株乳酸片球菌、1株戊糖片球菌和2株植物乳酸菌，其中植物乳酸菌的产酸能力最强。杨子燕等[19]从云南省各地区发酵样品中分离出的120株干酪乳杆菌，筛选出4株耐酸耐盐并且能抑制肠道致病菌的干酪乳杆菌，对活性乳酸菌饮品的生产具有重大意义。由此可见，本研究从甘蔗尾中分离出了20株乳酸菌菌株作为青贮发酵过程中的优势菌株，有潜力成为青贮饲料的乳酸菌添加剂。

表3 乳酸菌菌株产酸能力Table 3 Acid production of lactic acid bacteria strains

产酸能力直接影响青贮产品的品质，也是优质乳酸菌筛选的一个重要指标。Medonald等[20]和Woolford[21]提出，作为青贮发酵剂的优质乳酸菌应具有均一发酵途径，在厌氧条件下利用饲料中的碳水化合物，如乳糖、葡萄糖、果糖等各种糖类，尤其是戊糖，快速发酵产生大量有机酸，从而快速降低发酵体系的pH，使pH降到4.0以下，以抑制其他微生物的生长。本研究中筛选出的20株乳酸菌菌株在培养18 h后pH均可降到3.70以下，说明产酸能力较强。杨承剑等[17]从木薯渣中分离的4株乳酸菌发酵液在6 h内pH降低幅度较大，15 h后均可降到4.0以下，其中植物乳杆菌的产酸能力最强，pH是3.50。本研究分离的植物乳杆菌pH也可达3.57。20株乳酸菌发酵液pH均在3.70以下，具有良好的青贮潜能，给优良的青贮饲料添加剂的开发和制备提供了依据，但是多种菌株如何搭配使用和添加剂量多少的确定方面，以及是否可以大规模化利用及产品化等方面的研究，还需要进一步探索。

4 结论

本研究从打包青贮的甘蔗尾中分离筛选出了20株乳酸菌菌株，经鉴定得到干酪乳杆菌1株，副干酪乳杆菌2株，植物乳酸杆菌17株。这20株菌株产酸能力较强，培养18 h后菌株发酵液pH可将至3.70以下，Y67菌株的pH最低，为3.57。本研究通过传统的培养分离技术和现代分子生物学分析方法，对打包青贮的甘蔗尾上的乳酸菌进行了分离筛选和鉴定，此20株菌株均可用于甘蔗尾饲料的青贮发酵，为甘蔗尾或其他饲料青贮添加剂的开发提供了依据。