坡耕地土壤微生物功能多样性对间作体系的响应

许建晶，罗珠珠，陈 英

（1. 甘肃农业大学资源与环境学院，甘肃 兰州 730070；2. 甘肃省干旱生境作物学省部共建国家重点实验室，甘肃 兰州 730070）

间作种植模式在农业生产中已被广泛研究与应用，合理的间作可明显提高作物产量[1]、防治病虫害[2-3]以及改善根际营养条件[4]，还可以规避市场风险，带来经济效益[5]。目前，间作物种根系之间和根际微生物之间的相互作用已成为间作研究的重点。相关研究表明，土壤根际微生物群落的组成受土壤形态、植物种类的影响[6]，在间作模式下，不同作物的根系直接接触，根系周围的微生物之间也会相互作用，对彼此产生影响。该结果可能是两种作物根际微生物群落共同发挥作用导致的，也可能是其中一种植物根际微生物主导整个土壤体系发挥作用。国内学者针对玉米(Zea mays) || 马铃薯 (Solanum tuberosum)[7]、桑树 (Morus) ||苜蓿 (Medicago)[8]、小麦 (Triticum aestivum) || 苜蓿[9]和小麦 ||蚕豆 (Vicia faba)[10]等不同种类作物间作模式的研究均表明，间作种植可明显提高根际土壤微生物的生理活性，促进对土壤碳源的利用，从而提升土壤微生物群落功能多样性。

陇中黄土高原地区水土流失严重，土地生产力低下，同时，成片的丘陵沟壑区限制了农业机械化的实施。因此，选择适宜的间作种植模式引入到当地的农业生产实践，能够利用不利的地形特点进行农业增收。马德举等[11]认为，间作物种的选择应该符合3个原则：1)区域适应性强，2)生态效应好，3)具有一定的经济效益。杨远祥等[12]认为间作植物应根系深、耐干旱贫瘠。因此，因地制宜选择合理的间作作物对区域的长远发展具有重要意义。甘草(Radix glycyrrhizae)和菘蓝(Isatis tinctoria)是干旱、半干旱地区重要的耐旱植物资源，也是常用的大众药材，紫花苜蓿(Medicago sativa)是多年生牧草植物，对抑制水土流失、改善土壤结构起到重要的作用。因此，本研究选择甘草、菘蓝、紫花苜蓿分别与旱作春小麦间作，利用Biolog微孔板鉴定技术，研究不同间作模式下土壤根际微生物群落对土壤碳源利用模式的变化，从土壤微生物群落功能多样性角度解释不同间作模式对土壤微生物功能多样性的影响，以期丰富间作系统的研究理论，并为西部黄土高原雨养农业系统生产力可持续发展提供理论参考。

1 研究区概况与研究方法

1.1 研究区概况

试验地位于甘肃省定西市李家堡镇，研究区属黄土高原丘陵沟壑区，山多川少、地形破碎、水土流失严重。该区属中温带半干旱区，平均海拔2 000 m，年均太阳辐射 592.9 kJ·cm-2，日照时数2 476.6 h，年均气温 6.4 ℃，≥ 0 ℃ 年积温 2 933.5℃·d，≥ 10 ℃ 年积温 2 239.1 ℃·d；无霜期 140 d，年均降水量 390.9 mm，年蒸发量 1 531 mm，干燥度2.53，为典型的雨养农业区。地带性土壤为黄绵土，土质绵软，土层深厚，质地均匀，储水性能良好。研究区土壤基本理化性质为，土壤容重1.24 kg·m-3，有机质 7.25 g·kg-1，全氮 0.83 mg·kg-1，全磷 1.83 mg·kg-1，全钾 18.38 g·kg-1，pH 8.32。

1.2 研究方法

1.2.1 试验设计

试验设在一块6°～8°的缓坡地块上。以甘草、菘蓝两种地道药用经济作物和紫花苜蓿及旱作春小麦为供试作物，甘草、菘蓝、紫花苜蓿与旱作春小麦带状种植。其中旱作春小麦与菘蓝均于2017年3月中旬播种，旱作春小麦于同年7月下旬收获，菘蓝于10月初收获，甘草和紫花苜蓿为多年生作物(2015年试验设置初种植)。试验田间布置如图1所示。

试验小区呈“S”型分布，每个小区面积为5 m ×8 m，共设有4个处理，每个处理3次重复。各处理分别为小麦单作 (Wheat, W) (Plot1、Plot5、Plot10)：无植物篱，小麦采用当地常规耕作方式；小麦 || 甘草 (篱 )间 作 (Wheat || Liquorice, W || L) (Plot2、Plot8、Plot11)：带宽 4 m，甘草 (篱)、小麦幅宽均为 2 m， 每 小 区 各 两 带 ； 小 麦 || 菘 蓝 (篱 )间 作(Wheat || Woad, W || I) (Plot3、Plot7、Plot12)：带宽 4 m，菘蓝(篱)、小麦幅宽均为2 m，每小区各两带；小麦 || 苜 蓿 (篱 )间 作 (Wheat || Alfalfa, W || A) (Plot4、Plot6、Plot9)：带宽 4 m，苜蓿 (篱)、小麦幅宽均为2 m，每小区各两带。

1.2.2 土壤样品的采集与测定

图1 试验小区田间布置Figure 1 Experiment plot field layout

定位试验设置于2015年，2017年4月春小麦苗期，利用五点法采集12个试验小区0-10 cm、10-30 cm土层的供试土样，间作处理下的土壤在小麦和间作作物的交汇地带(2 m内)采集。将采集的土样混合均匀，并过2 mm的筛除去土样中的植物根系、落叶、石块等，然后装入小号密封袋中置于4 ℃冰箱保存，在一周内进行土壤微生物功能多样性指标的测定。

1.2.3 土壤微生物碳源代谢功能及其相关指数的计算

（3）信息共享化。将BIM技术应用于建筑工程项目管理中，可以从建筑工程项目设计始，至建筑工程项目完成均可以通过计算机技术模拟，甚至是建筑项目工程的废弃拆除全过程，利用BIM技术能够将建筑工程项目全过程实现在业主方、施工方等多方信息共享，对提升建筑工程施工决策的科学化水平具有积极的现实意义。

采用 Biolog 生态微平板 (BIOLOG Eco Plate TM)测定[13]。通过测定各个生态板孔的吸光值随着培养时间的变化，反映微生物群落功能多样性。称取相当于10 g干土的鲜土样放入装有 90 mL 0.85%的NaCl无菌溶液的三角瓶中，加无菌棉花置于摇床上振荡30 min后，在制备好的悬液中加入NaCl溶液，配制成稀释比例为1∶100的Eco板接种液(将Biolog-eco板从冰箱里取出，在25 ℃条件下活化24 h)。在超净工作台上，将准备好的样品溶液接种于Eco微平板上，将接种好的微孔板放在保湿的容器中，并放入25 ℃的恒温培养箱中黑暗连续培养216 h(9 d)，培养期间每隔 24 h 用反应微平板读数器在590 nm处读数，直至读数不再变化为止。

生物代谢强度采用平均颜色变化率(average well color development, AWCD)表征计算公式如下：

式中：Ci为各反应孔在590 nm下的光密度值；R为Eco板对照孔的光密度值；Ci-R ＜ 0的孔均在计算中记为零，即Ci-R均 ≥ 0。采用孔平均颜色变化率法测定土壤微生物利用单一碳源的能力。

将培养96 h获得的数据进行统计分析，利用Shannon-Wiener多样性指数(H)、Simpson优势度指数(D)以及McIntosh均匀度指数(U)表征微生物群落代谢功能的多样性，计算公式如下：

式中：Pi为第i孔的相对吸光值与平板所有反应孔相对吸光值总和的比率，即 Pi= (Ci- R)/Σ(Ci- R);ni为第i孔的相对吸光值。

土壤微生物群落Richness丰富度指数(S)采用反应孔(吸光值 ＞ 0.2，则代表该孔的碳源被利用，该孔为反应孔)的数目表示[14]。

1.2.4 数据处理

2 结果

2.1 不同处理的土壤微生物平均颜色变化率

AWCD作为反映土壤微生物群落利用单一碳源的重要指标，随着培养时间的变化曲线可以揭示土壤微生物群落的代谢强度[15]。图2显示了间作定位试验在4种不同处理下0-10 cm、10-30 cm土层AWCD随培养时间的变化情况。总的变化趋势：不同处理下AWCD均随培养时间的延长而增长，即微生物利用碳源的总量呈增长趋势，但各处理下AWCD增长幅度不同；各处理下AWCD随土层深度增加而减小，土层越深，微生物利用碳源的总量就越少；在0-24 h内，AWCD均无明显变化，说明在24 h内，碳源基本未被利用；培养24 h后，土壤微生物逐渐适应BIOLOG微平板基质环境进入对数增长期。W || I处理下的AWCD在整个研究土层均高于其他处理，统计分析表明：在10-30 cm 土层，W || I处理下的 AWCD 在培养的增长期同同 W ||L 处理差异显著 (P＜0.05) 。由以上分析可以得知，采用小麦||菘蓝间作处理可以提高土壤微生物的碳源利用能力和整体代谢活性。

2.2 不同处理的土壤微生物群落指数

图2 土壤微生物群落AWCD随培养时间的变化Figure 2 AWCD changes with different incubation times

表1 土壤微生物群落指数(96 h)Table 1 Diversity indices of soil microbial communities of 96 h

土壤微生物群落对基质碳源的利用程度可以采用多样性指数表示，结果表明(表1)，微生物培养96 h 时，在 10-30 cm 土层 W || L 与 W || I的 AWCD值差异显著(P＜0.05)。4种指数均随土层深度增加而逐渐变小，但在 0-10 cm、10-30 cm土层中Shannon-Wiener和Simpson指数在小麦单作和间作之间均无显著差异(P ＞ 0.05)；而McIntosh指数表现为小麦单作和间作差异显著(P＜0.05)，其中0-10 cm土层土壤 W || L 和 W || I显著高于单作，10-30 cm土层以W || I效果显著显著高于单作；Richness指数则表现为间作 ＞ 单作，在 0-10 cm 土层 W 与 W || I差异显著 (P＜0.05)。与小麦单作相比，小麦 || 菘蓝间作可以提高0-10 cm土壤的均匀度和丰富度指数。

2.3 不同处理的土壤微生物对碳源利用模式的变化

4种不同处理下土壤微生物对六大类碳源的利用强度如图 3所示。0-10 cm 土层，W || L 处理下土壤微生物对羧酸类、多聚物、糖类和氨基酸这4类碳源的利用强度分别是W的 1.35、1.39、1.45和 1.24倍；W || I处理下土壤微生物对羧酸类、糖类、酚酸类和氨基酸类碳源的利用强度分别是W处理的1.8、1.3、2和1.2倍；W || A处理对六大类碳源的利用强度与W差别不大。在多聚物和糖类的利用强度上，W || L处理显著高于W ||A 处理 (P＜0.05)，而 W || I处理下酚酸类的利用强度显著高于 W 和 W || A 处理 (P＜0.05)。在 10-30 cm土层，W || I处理下土壤微生物对六大类碳源的利用强度均高于W处理，分别是W的1.3、1.1、1.4、5.2、1.1和 2.3倍；W || A 处理对羧酸类和胺类碳源的利用强度高于W处理。在酚酸类的利用强度上，W 和 W || L 处理差异显著不显著 (P ＞ 0.05)，二者显著低于 W || I和 W || A 处理 (P＜0.05)；在胺类的利用上 W || I处理显著高于 W || L 处理 (P＜0.05)。

2.4 土壤微生物对碳源利用多样性的主成分分析

主成分分析是处理数学降维的一种方法，将多个变量通过线性变换以选出较少个数重要变量。主成分个数的提取原则是相对应特征值 ＞ 1的前几个主成分。根据此原则本研究在0-10 cm土层的31个因子中提取了5个主成分，累计贡献率达到92.85%，其中PC1为53.12%，权重最大，PC2次之，为14.65%，PC3～PC5较小；10-30 cm土层提取了6个主成分，累计贡献率达到95.39%，其中PC1为42.92%，权重最大，PC2次之，为18.74%，PC3～PC6较小。可见，各土层均表现为前2个主成分是变异的主要来源，能够解释绝大部分变异，故本研究选取前2个主成分来表征微生物群落碳源代谢特征，以此解释微生物群落利用碳源的功能多样性。

图3 不同处理下土壤微生物对6类碳源的利用强度Figure 3 Utilization intensity of microbes to six types of carbon source in different treatments

图4 土壤微生物碳源利用图谱主成分分析Figure 4 Principal component analysis of carbon sources utilization of soil miccrobes

0-30 cm土层的PCA分析图谱如图4所示，0-10 cm 土层，在 PC1轴上，W || L 分布在正方向，得分区间为 0.98～1.28，W || A 分布在负方向，得分区间-1.20～-0.80，而 W 和 W || I其主体都分布在负方向；在PC2轴上，W || L(-0.42～-0.33)和 W || A(-0.97～-0.27)得分值都为负值，W || I的得分为正，区间在0.68～1.32，W的得分为-1.42～2.4）。10-30 cm 土层，在 PC1轴上，W ||I和W || A分布在正方向，得分区间为0.34～2.04，W || L 分布在负方向，得分区间在-0.43～-0.14，W主体均在正方向；在PC2轴上，除W || L分布在正方向外，其他处理在正负方向都有分布。从分布象限上看，0-10 cm 土层，W || L 的投射点分布在第四象限，W || I与 W || A、W 的投射点主体分布在第二、三象限；10-30 cm 土层，W || L 的投射点分布在第二象限，W || I、W || A 和 W 的投射点主要分布在第一、四象限。这表明W || L在耕层0-30 cm土壤与其余各处理在空间分布上有较明显的距离，甘草的种植导致了土壤微生物群落代谢功能的变化。

研究同时发现，在 0-30 cm 土层，W || L、W || I与W || A在PC轴上的空间分布离散度较小，这说明在甘草、菘蓝、苜蓿间作的影响下土壤微生物群落稳定性强，因为甘草、菘蓝、苜蓿的根系都比较发达，其提供了大量分泌物和碳源，维持了土壤微生物群落稳定性的生存环境，而W得分系数差异很大，其土壤微生物群落稳定性差。

2.5 土壤微生物碳源利用载荷因子分析

不同种植模式下土壤微生物碳源利用能力存在差异，且不同处理下主成分轴上的差异与聚集在该轴上微生物利用碳源底物的能力相关联。主成分的初始载荷因子反映了微生物对土壤碳源利用和所提取主成分之间相关性的大小。载荷因子为正值，二者正相关，反之则为负相关。碳源的初始载荷因子绝对值越大，说明该碳源对微生物代谢的影响越大[16]。本研究选取载荷因子大于0.5的碳源作为与PC1和PC2显著相关的碳源[11]。从表2可以看出，在0-10 cm土层范围内，第一主成分PC1荷载因子在0.5以上的有19种基质碳源，其中因子载荷在0.8以上的有14种，糖类5种、氨基酸类3种、羧酸类3种、多聚物2种，胺类1种，其中N-乙酰-D-葡萄糖的载荷因子最大，为0.911；第二主成分PC2的荷载因子在0.5以上的有18种碳源，分别为氨基酸类5种、羧酸类2种、酚酸类2种、糖类6种，载荷因子最大的是α-D-葡萄糖-1-磷，说明糖类碳源对0-10 cm土层内土壤微生物的碳代谢影响最大。同理，糖类和多聚物类碳源对10-30 cm土层内土壤微生物的碳代谢影响最大。在0-30 cm土层内土壤微生物的碳代谢影响随土层深度的增加而降低。所以，0-30 cm土层土壤微生物对糖类碳源物质能力不同导致土壤微生物生理曲线的差异。

3 讨论

粮草(药)间作定位试验表明：AWCD变化符合微生物常规生长曲线，小麦 || 菘蓝间作的AWCD值在0-30 cm土层高于小麦单作；与小麦单作相比，间作甘草和菘蓝可以显著提高McIntosh指数；甘草的种植导致了土壤微生物群落代谢功能的变化；糖类是土壤微生物利用的主要碳源，而小麦 || 苜蓿间作提高了0-30 cm土层土壤微生物对羧酸类碳源的利用比例。

AWCD随培养时间的变化曲线可以反映土壤微生物群落的代谢特征，用以比较微生物利用碳源的速度[17]。本研究结果表明，4种处理下AWCD随着培养时间的延长表现为微生物常规生长曲线，即“S”型增长，说明土壤微生物利用碳源的能力随着培养时间的延续而逐渐增强。AWCD值越高，土壤微生物利用碳源底物的能力越强[18]，在整个培养过程中，小麦 || 菘蓝间作的AWCD值在0-30 cm土层都高于小麦单作，由此可见，采用菘蓝间作种植模式可以提高土壤微生物群落代谢能力，促进土壤微生物对底物碳源的利用能力。小麦与菘蓝共生期间，一方面根系分泌物的质量和数量均增加，间作小麦不仅会分泌苹果酸和柠檬酸，还会分泌乙酸、丁二酸和草酸等，根系分泌物引起土壤微生物数量和微生物群落结构的变化。另一方面选择间作的菘蓝系根系发达植物，能够吸收深层养分。但采用不同作物间作效果是不同的，张桂国等[19]研究苜蓿 || 玉米间作时发现，苜蓿的固氮作用会加强玉米根系对氮元素的吸收，从而使玉米表现为间作产量优势；而朱静等[20]的研究则发小麦分泌物丁香酚可加剧间作模式的化感抑制作用。微生物利用碳源的能力随着土层深度的增加而降低。

多样性指数能够比较微生物群落的功能多样性差异。逢好胜等[21]在研究小麦 || 苜蓿间作对 0-5 cm土壤微生物群落功能多样性的影响时指出间作苜蓿和间作小麦可以提高土壤微生物群落McIntosh指数。本研究结果表明，在0-10 cm土层，与小麦单作相比，间作甘草和菘蓝可以显著提高McIntosh指数，间作苜蓿下的McIntosh指数则低于小麦单作，但随着土层加深，间作苜蓿的McIntosh指数开始显著高于单作小麦。由于苜蓿根系发达，其对土壤生化性质的影响可能在深层土壤表现更为明显。间作甘草和菘蓝可以提高表层(0-10 cm)土壤微生物群落Shannon-Wiener指数和Simpson指数，但与小麦单作的差异并不显著，这可能是由于试验年限较短所致，还需后期进一步研究。

主成分分析可以解释不同处理土壤微生物对碳源利用的差异[16]。在本研究结果中，小麦 || 甘草集中分布于主成分图谱，表明甘草的种植导致了土壤微生物群落代谢功能的变化。间作使土壤微生物群落稳定性增强。由于植物在生长发育过程中向根部不断释放各种有机物质，不但能调节植物对矿质元素的吸收和抵御外界环境压迫，而且能维持土壤微生物的活性[22]；两种植物间作，由于植物的种间竞争和种间促进作用[23]，会改变植物根系分泌物的含量和成分组成，就势必会影响到土壤微生物的种群结构和功能，即改变了土壤微生物群落功能利用能力和碳源的利用种类。本研究结果表明：糖类是土壤微生物利用的主要碳源，而小麦 || 苜蓿间作使得0-30 cm土层土壤微生物对羧酸类碳源的利用比例大幅度提高，可见，在根系的交互作用影响下，有利于土壤中羧酸类碳源的微生物种群增长。

综合土壤微生物对碳源利用的动力学特征、土壤微生物多样性指数以及碳源利用多样性主成分分析的结果，与单作相比，粮草(药)间作种植在提高土壤微生物功能多样性，维系群落稳定性、改善土壤质量方面具有明显优势。