间作大葱对桔梗根系分泌物的影响

王菲　孙文帅　张秀婷　衣凌飞　祝丽香　葛春妹　孙湄婷

摘要：為探究间作大葱有效消减桔梗连作障碍的机理，本试验选取桔梗连作5年的地块进行研究，设置桔梗单作、大葱单作和桔梗大葱间作行比3∶2、4∶2、5∶2共5个处理，利用原位取土法收集不同处理的根际土，并进行根系分泌物的提取与GC-MS分析。结果表明，单作桔梗和桔梗大葱间作根系分泌物中2，2′-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）相对含量高达23.51%～39.63%，而且桔梗大葱间作根系分泌物中该物质相对含量显著高于单作桔梗和单作大葱;间作大葱提高桔梗根系分泌物中角鲨烯、β-谷甾醇、岩皂甾醇等抗胁迫物质和苯并噻唑、2-甲硫基苯并噻唑这类杀菌抑菌物质的相对含量，同时提高桔梗根系分泌物中喹啉、二苄胺、N-（1，3-二甲基丁基）-N′-苯基对苯二胺等碱性物质的相对含量，降低三十六烷、N，N-二甲基十二酰胺、苯乙烯、十五烷、十七烷相对含量，有效改善间作土壤微环境。综上所述，间作大葱改变了间作体系中桔梗根系分泌物的组成成分和相对含量，增加了桔梗根系分泌物中生长促进型化感物质的相对含量，降低抑制型化感物质的相对含量，改善间作桔梗根际微环境，有效消减桔梗连作障碍。

关键词：桔梗;大葱;间作;单作;根系分泌物

中图分类号：S344.2文献标识号：A文章编号：1001-4942（2019）11-0068-06

Effects of Intercropping Allium fistulosum on

Root Exudates of Platycodon grandiflorum

Wang Fei， Sun Wenshuai*， Zhang Xiuting， Yi Lingfei， Zhu Lixiang， Ge Chunmei， Sun Meiting

（Agronomy College， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China）

Abstract To clarify the alleviating mechanism of continuous cropping obstacle of Platycodon grandiflorum intercropped with Allium fistulosum， the plot of continuous cropping for 5 years was selected in this experiment. There were five treatments： P. grandiflorum monoculture， A. fistulosum monoculture， and intercropping of P. grandiflorum with A. fistulosum at row ratio of 3∶2， 4∶2 and 5∶2. The rhizosphere soil of different treatments was collected by in situ soil sampling method， and the root exudates were extracted and analyzed by GC-MS. The results showed that the relative content of 2， 2′-methylene bis-（ 4-methyl-6-tert-butylphenol） in root exudates of P. grandiflorum was 23.51%～39.63%， and that was significantly higher in the intercropped P. grandiflorum than that in monoculture. The relative contents of squalene， beta-sitosterol， saponin sterol， benzothiazole and 2-methylthiobenzothiazole in intercropped P. grandiflorum increased， and the relative contents of quinoline， dibenzylamine， N-（1，3-dimethylbutyl）-N′-phenylp-phenylene-diamine also increased， while the relative contents of hexatriacontane， N， N-dimethyldodecamide， styrene， pentadecane and heptadecane decreased， which effectively changed the soil microenvironment of intercropping. In conclusion， P. grandiflorum intecropped with A. fistulosum changed the component and relative content of root exudates of P. grandiflorum， increased contents of growth-promoting allelochemicals and decreased that of inhibiting allelochemicals， thus improving the rhizosphere microenvironment and effectively alleviating the cropping obstacle of P. grandiflorum.

Keywords Platycodon grandiflorum; Allium fistulosum; Intercropping; Monoculture; Root exudates

桔梗（Platycodon grandiflorus）为多年生草本植物，根可入药，需求量较大，连续种植易产生连作障碍，突出表现为病害高发。Qi[1]、韩雪[2]等认为药用植物连作障碍的原因可能是土壤病原微生物以根系分泌物中的特定组分为养分来源，而连作能够持续为其提供营养，使其数量剧增，从而破坏土壤微生态平衡，致使土传病害蔓延。祝丽香等[3]发现桔梗全株自毒作用明显，地上部分淋溶物和植株残茬腐解物产生的化感物质是导致连作桔梗减产、品质下降的主要原因之一。进一步研究发现，桔梗连作田土壤微生物群落结构与第一年种植地块显著不同，主要表现为连作地块土壤细菌数量显著下降，真菌数量急剧增加，细菌/真菌比值显著降低[4]。

根系分泌物是植物与环境相互作用的媒介，是调控根际微生态的关键因子[5]，可为土壤微生物提供营养来源，进而调控根际微生物群落结构。已有研究表明西洋参[6]、人参[7]、三七[8]、半夏[9]根系分泌物中含有的化感物质是连作障碍产生的主要原因。不同植物的根系分泌物具有独特性，间作可增加田间植物种类，增加土壤中根系分泌物种类，并改变其含量，影响土壤微生物群落结构。研究已证实桔梗与薄荷、当归与大蒜间作时，桔梗、当归连作障碍明显减轻。薄荷、大蒜全株含有许多挥发性成分，根系分泌物具有抑菌活性，间作消减连作障碍的主要原理是利用植物与病原菌之间的化感效应[5]。大葱分泌的含硫化合物能够氧化巯基并对含硫氧基的化合物如肌氨酸、谷氨酸等产生竞争性抑制，从而杀灭多种病原菌[10]。时伟等[11]研究发现大葱根系分泌物可改善连作黄瓜的土壤微生态环境;徐宁[10]证实大葱黄瓜间作有效降低黄瓜枯萎病发病率的主要原因是大葱根系分泌物抑制黄瓜枯萎病病原菌的生长;王鹏等[12]也发现间作大葱能改变土壤微生态环境、促进桔梗养分吸收、提高桔梗产量、有效减轻桔梗连作障碍。但均未涉及间作大葱是否影响桔梗根系分泌物组成。

基于此，本研究在桔梗连作5年的地块进行桔梗单作、大葱单作和桔梗大葱按照行比3∶2、4∶2、5∶2间作种植，研究间作大葱对桔梗根系分泌物的影响，以期阐明间作大葱有效消减桔梗连作障碍的机理。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验于2018年在山东农业大学实验站进行。该地位于东经116.06°、北纬36.20°，海拔175.4 m，属于温带半湿润季风气候区，年平均气温、≥0℃和≥10℃的积温分别为13.5、4 721、4 313℃，无霜期平均194 d，年平均降水量687.3 mm。

试验田为桔梗连作5年地块，中壤土，有机质和碱解氮、速效磷、速效钾分别为7.23 g/kg和47.63、29.30、53.19 mg/kg，pH=6.3。

1.2 试验设计

试验采用随机区组设计：桔梗单作、大葱单作和桔梗大葱行比3∶2、4∶2、5∶2间作共5个处理，分别标记为SJG、SDC、IJC32、IJC42、IJC52。小区面积为10 m2，重复3次。桔梗、大葱均采用种苗移栽，移栽时间为4月11日;高畦种植，畦南北走向，高15 cm、宽100 cm、间距45 cm。畦面上东西方向种植，株行距5 cm×20 cm。常规管理，保持田间无杂草。

于8月24日田间收集根系分泌物。具体方法：各处理分别挖取长势一致的作物，轻轻抖落大块不含根系的土壤，后取根际土500 g，用冰盒带回实验室。精确称取土样20 g，加入50 mL正己烷，30℃超声提取1 h，继而利用TH-111D 恒温振荡器35℃振荡24 h，将提取液过滤、减压浓缩后定容至5 mL，过0.22 μm微孔滤器后用于GC-MS分析。

1.3 测定指标及方法

提取的根系分泌物用气相色谱-质谱联用仪进行分析。色谱条件如下：色谱柱为InertCap-1（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）;载气：氦气，初始压力500～900 kPa，氦气的流量1 mL/min;进样口温度：250℃;进样量：1 μL;进样方式：不分流进样;柱温箱升温程序：50℃保持1 min，然后以5℃/min程序升温至200℃，保持3 min，再以10℃/min升温至260℃，保持35 min;总运行时间为75 min。质谱条件如下：电子轰击源电子能量为70 eV;离子源温度200℃;接口温度250℃;载气为氮气;溶剂延迟时间 2 min;采集方式：Q3Scan;扫描范围M/Z 45-500。

对得到的各成分的质谱图进行计算机质谱库（NIST08）检索和人工解析，确定化合物结构。根据质谱离子流图的峰面积，应用校正峰面积归一法确定各化合物的相对含量。

1.4 数据分析

试验数据采用Microsoft Excel 2016进行统计分析，用R软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 桔梗、大葱根系分泌物共有组分分析

桔梗、大葱根系分泌物中共鉴定出39种化合物，包括烃类18种、脂肪酸类3种、苯类4种、苯酚类2种、胺类3种、醇类2种、含硫化合物2种、杂环类化合物5种。经分析发现，不同处理的根系分泌物有19種共有化合物（表1）。其中，烃类化合物6种：2，4-二甲基庚烷（2，4-dimethyl-heptane）、二十烷（eicosane）、十四烷（tetradecane）、正三十六烷（hexatriacontane）、烷烃类化合物[15-isobutyl-（13.alpha.H）-isocopalane]、角鲨烯（squalene），该类化合物在单作桔梗、间作桔梗和单作大葱根系分泌物中的相对含量分别为23.59%、18.20%～23.03%和19.19%;脂肪酸类化合物2种：棕榈酸甲酯（hexadecanoic acid，methyl ester）和乙酸十八脂（acetic acid n-octadecyl ester），在桔梗、大葱根系分泌物相对含量仅为3.90%～5.57%;苯类化合物仅甲苯（Toluene）1种;苯酚类化合物2种：2，4-二叔丁基苯酚（2，4-di-tert-butylphenol）和2，2′-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）[2，2′-methylenebis（6-tert-butyl-4-methyl Phenol）]，单作桔梗、间作桔梗和单作大葱根系分泌物中该类化合物相对含量分别为25.64%、37.90%～43.25%、39.45%;胺类化合物3种：N-（1，3-二甲基丁基）-N′-苯基对苯二胺（1，4-benzenediamine，N-（1，3-dimethylbutyl）-N′-phenyl）、二苄胺（dibenzylamine）和N，N-二甲基十二酰胺（N，N-dimethyldodecanamide），单作桔梗、间作桔梗和单作大葱根系分泌物胺类化合物相对含量分别为29.27%、16.17%～18.86%、19.25%;含硫化合物2种：苯并噻唑（benzothiazole）、2-甲硫基苯并噻唑[2-（methylmercapto）benzothiazole];其它类化合物3种：2，2，4-三甲基-1，2-二氢喹啉（1，2-dihydro-2，2，4-trimethyl quinoline）、十二甲基环六硅氧烷（dodecamethylcyclohexasiloxane）、β-谷甾醇（β-sitosterol）。

与单作桔梗相比，桔梗大葱间作根系分泌物中增加了角鲨烯、β-谷甾醇、棕榈酸甲酯、乙酸十八脂、2，4-二叔丁基苯酚、2，2′-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）、二苄胺、N-（1，3-二甲基丁基）-N′-苯基对苯二胺、2，2，4-三甲基-1，2-二氢喹啉、苯并噻唑、2-甲硫基苯并噻唑组分的相对含量。

桔梗大葱间作根系分泌物中2，4-二叔丁基苯酚比单作桔梗增加41.31%～69.95%，比单作大葱增加2.38%～23.13%;2，2′-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）比单作桔梗增加48.40%～68.57%;角鲨烯比单作桔梗增加69.94%～185.76%，比单作大葱增加30.98%～120.24%。

单作桔梗根系分泌物中正三十六烷、N，N-二甲基十二酰胺的相对含量比桔梗大葱间作分别增加114.97%～210.24%、187.26%～249.92%，比单作大葱分别增加89.27%、272.22%。

2.2 桔梗、大葱根系分泌物中特有组分分析

由表2、图1可以看出，单作桔梗、桔梗大葱间作和单作大葱各有其特殊的根系分泌物组分。单作桔梗根系分泌物共30种，六甲基环三硅氧烷（hexamethylcyclotrisiloxane）、苯乙烯（styrene）、十五烷（pentadecane）、十七烷（heptadecane）为特有组分。单作大葱根系分泌物共26种，癸烷（decane）为特有组分。桔梗大葱3∶2间作体系桔梗分泌物共24种，特有组分为双降藿烷和乙酸二十四酯（tetracosyl acetate），桔梗大葱4∶2间作体系桔梗分泌物共26种，特有组分为5-（2-甲丙基）壬烷[5-（2-methylpropyl）nonane）]，桔梗大葱5∶2间作体系桔梗分泌物共23种，特有组分为二环己胺。与单作大葱和单作桔梗相比，桔梗大葱间作根系分泌物组分增加了岩皂甾醇。

2.3 桔梗大葱间作根系分泌物组分的热图分析

根据单作桔梗、桔梗大葱间作和单作大葱根系分泌物在桔梗、大葱不同种植模式中的相对含量，利用R软件进行聚类分析并通过热图呈现（图2）。

Ⅰ 类包括二十烷、 N-（1，3-二甲基丁基）-N′-苯基对苯二胺、二苄胺、苯并噻唑、2-甲硫基苯并噻唑、（3β，24Z）- 岩皂甾醇、乙酸十八脂、β-谷甾醇、烷烃类化合物、2，2′-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）、2，2，4-三甲基-1，2-二氢喹啉、2，4-二叔丁基苯酚、棕榈酸甲酯。这类化合物在桔梗大葱间作根系分泌物中相对含量高于单作大葱和单作桔梗。

Ⅱ类包括2，6，11-三甲基十二烷、双降藿烷和乙酸二十四酯，这类化合物在桔梗大葱间作的根系分泌物相对含量高于单作桔梗。2，6，11-三甲基十二烷在桔梗大葱5∶[KG-*2/3]2间作桔梗根系分泌物中的相对含量显著高于桔梗大葱3∶[KG-*2/3]2间作。

Ⅲ类包括角鲨烯、十二甲基环六硅氧烷、十四甲基环五硅氧烷、十甲基环五硅氧烷、十二烷、5-（2-甲丙基）壬烷、2，5-二甲基壬烷、十四烷、甲苯、苯酚类化合物。这类化合物在桔梗大葱4∶[KG-*2/3]2间作桔梗根系分泌物中相对含量最高。

Ⅳ类包括癸烷、邻二甲苯、4-甲基辛烷、2，4-二甲基-1-庚烯和乙苯，这类化合物主要存在于单作桔梗或单作大葱的根系分泌物中。

Ⅴ类包括六甲基环三硅氧烷、十七烷、苯乙烯、十五烷、N，N-二甲基十二酰胺和正三十六烷，这类化合物主要存在于单作桔梗根系分泌物中。

Ⅵ类包括二环己胺、2，4-二甲基庚烷，这类化合物主要存在于桔梗大葱5∶[KG-*2/3]2间作桔梗的根系分泌物中。

3 讨论与结论

根系分泌是植物适应环境的一种表现，植物能够根据周围环境的变化调整根系分泌物的组成和数量。由于植物根系所处的环境变化多样，同种化合物是否产生化感作用依赖于这种化合物在根系周围的浓度及其在土壤中的转化特点[13]。此外，化合物的化感作用具有浓度依赖性，即低促高抑。棕榈酸甲酯、乙酸十八脂、甲苯等是常见的化感物质[14，15]，本研究发现，它们在单作桔梗和桔梗大葱间作根系分泌物中的相对含量仅1%～4%，不足以达到化感抑制所需浓度。此外，还发现单作桔梗和桔梗大葱间作根系分泌物中2，2′-亚甲基雙-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）相对含量约是2，4-二叔丁基苯酚相对含量的10倍，高达23.51%～39.63%，推测其是桔梗根系分泌物中主要化感物质，而且单作大葱和桔梗大葱间作中该物质相对含量显著高于单作桔梗。这与祝丽香[4]和王鹏[12]等通过研究证实的间作大葱能改善土壤生态环境、促进桔梗养分吸收、有效缓解桔梗连作障碍一致。由此证明桔梗大葱间作根系分泌物中2，2′-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）是间作大葱缓解桔梗连障碍的主要化感相生物质。

岩皂甾醇和β-谷甾醇都属于植物甾醇类。Griebel等[16]发现在真菌性病原体引起生物胁迫时，植物根系调控植物甾醇的合成和分泌，从而改变细胞膜特性，抵抗病菌侵染。角鲨烯具有解毒、抗真菌作用[17]。桔梗大葱间作大幅增加根系分泌物中角鲨烯和β-谷甾醇含量;岩皂甾醇是桔梗大葱间作特有的根系分泌物，可以推测角鲨烯、β-谷甾醇和岩皂甾醇能够提高桔梗根系抗病性。赵丽静[18]研究发现苯并噻唑和2-甲硫基苯并噻唑抑制黄瓜枯萎病原菌菌丝生长。本研究桔梗大葱间作根系分泌物中苯并噻唑和2-甲硫基苯并噻唑的相对含量高于单作桔梗，说明间作大葱促进桔梗根系分泌该两种物质，能够抑制土壤中致病菌生长，这与李家家[19]、徐宁[10]等研究间作大葱能改善土壤微环境的结果一致。

杂环化合物如2，2，4-三甲基-1，2-二氢喹啉多具有抗菌、杀虫除草、调节植物生长等生物活性[20]。本研究中喹啉、二苄胺、N-（1，3-二甲基丁基）-N′-苯基对苯二胺均为碱性物质，可提高土壤pH值，而间作大葱增加了桔梗根系分泌物中这类化合物的相对含量。申太荣[21]认为大葱根系分泌物中这类物质协同改善间作黄瓜土壤微生态环境，由此推测该类物质有益于改善桔梗土壤微生态环境。

本研究中单作桔梗根系分泌物中正三十六烷、N，N-二甲基十二酰胺的相对含量比桔梗大葱间作分别增加114.97%～210.24%、187.26%～249.92%，比单作大葱分别增加89.27%、272.22%。兰英等[22]研究认为，酰胺类物质是丹参在环境胁迫下的主要分泌物，烷类化合物也是常见的化感物质。这充分说明连作条件下单作桔梗根系生长的土壤环境化感自毒物质含量高于间作桔梗。

综上所述，间作大葱改变了间作体系中桔梗根系分泌物的组成和相对含量。桔梗大葱间作根系分泌物中岩皂甾醇、2，4-二叔丁基苯酚、2，2′-亚甲基双-（4-甲基-6-叔丁基苯酚）、角鲨烯、N-（1，3-二甲基丁基）N′-苯基对苯二胺的相对含量高于单作桔梗，且岩皂甾醇是桔梗大葱间作根系分泌物中特有组分，推测这些物质在间作大葱改善土壤微生态环境中发挥重要作用。六甲基环三硅氧烷、苯乙烯、十五烷、十七烷是单作桔梗根系分泌物的特有成分，单作桔梗根系分泌物中正三十六烷、N，N-二甲基十二酰胺相对含量是桔梗大葱间作和单作大葱根系分泌物相对含量的1～4倍，由此推测正三十六烷、N，N-二甲基十二酰胺、六甲基环三硅氧烷、苯乙烯、十五烷、十七烷是桔梗根系分泌物中主要化感物质。

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收稿日期：2019-06-29

基金项目：国家级大学生创新创业训练计划项目（201810434058）

作者简介：王菲（1998—），女，山东青岛人，在读本科生，研究方向：中药资源与开发。E-mail： 18854800532@163.com

孙文帅（1993—），男，硕士研究生，研究方向：药用植物栽培。E-mail： 15065802215@163.com

*同为第一作者。

通讯作者：祝丽香（1965—），女，博士，副教授，研究方向：药用植物栽培、抗性生理、品种选育和种质资源评价。E-mail：zhulix1028@163.com