白三叶降解对陕西地区苹果园土壤酶活性的影响

杨文权，卢彪儒，程宇阳，魏倩倩，寇建村

（1. 西北农林科技大学生命科学学院，陕西 杨凌 712100；2. 青海省兴海县环境保护和林业局，青海 兴海 813300；3. 西北农林科技大学草业与草原学院，陕西 杨凌 712100）

我国是世界第一大苹果生产国，而以陕西、甘肃为代表的黄土高原地区是中国乃至世界上最大的苹果优势产区，该地区特殊的土壤和气候条件是生产优质苹果最主要的因素[1-2]。但是，黄土高原地区生产苹果有两个限制因子。第一是水分，苹果生产是一个高耗水过程，而黄土高原又是典型的雨养农业区，降水少而蒸发量大，这是该地生产苹果的一大障碍[3]；第二是土壤肥力，苹果生产需要大量的肥力，尤其是有机肥，但随着农业产业结构的调整及苹果种植面积的扩大，原来的厩肥、农家肥及秸秆等越来越少，可用于苹果园的有机肥源严重不足，因此，生产上主要以化肥为主，尤其是氮肥过量使用，造成了肥料的浪费及空气和地下水的污染[4-5]。为改善黄土高原苹果园的土壤水分和肥力，研究人员提出果园种草的栽培模式，即在果树行间种草，然后将草刈割后通过覆盖或埋置的方式返园，既能降低蒸发，保持土壤含水量，而果园草降解后，又能改善土壤肥力，为果园提供长期稳定的有机肥源[6-7]。但是，有关果园草的不同利用方式及对果园土壤生理生态功能的影响还鲜有报道。

研究表明，植物残体降解的本质就是特定条件下的酶解过程[8-9]，因此，植物残体降解对土壤酶活性有重要的影响[10-11]。土壤酶能加速土壤生化反应速率，酶活性大小可表征土壤中生物化学过程的强度和方向[12]，是观察土壤肥力的重要指标[13-14]。而土壤蛋白酶、蔗糖酶、脲酶以及磷酸酶与有机质数量、土壤呼吸强度等养分状况密切相关，对土壤肥力有重要的影响[15-17]。但是，目前对植物残体降解的研究多集中于秸秆还田以及森林凋落物等方面，而对于果园草覆盖或埋置后降解时对土壤酶活性影响的研究还鲜有报道[18-19]。为此，本研究以黄土高原地区苹果园最适宜的白三叶(Trifolium repens)为材料，在苹果典型优生区—陕西的洛川和旬邑苹果园中进行白三叶埋置降解试验，研究白三叶降解对不同苹果园土壤酶活性的影响，以为果园种草及果园草的合理利用提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于陕西省洛川县和旬邑县，均地处渭北黄土高原沟壑区。洛川县试验地设在延安市洛川县无公害苹果示范园，平均海拔1 100 m，年均气温 9.2 ℃，年降水量 622 mm，无霜期 167 d，日照时数 2 552 h，≥ 10 ℃ 年积温 3 040 ℃·d，土壤为疏松的黑垆土，土壤有机质含量为1.41%，全氮含量 0.07 g·kg-1，全磷含量 0.11 g·kg-1，全钾含量 1.47 g·kg-1，速效氮含量 11.1 g·kg-1，速效磷含量 16.2 g·kg-1，速效钾含量 171.3 g·kg-1。旬邑县试验地设在旬邑县原底乡，平均海拔1 300 m，年均气温9.0 ℃，年降水量 600 mm，无霜期 179 d，日照时数 2 390 h，≥ 10 ℃ 年积温2 956 ℃·d，土壤为粘黑垆土，土壤有机质含量为1.38%，全氮含量0.11 g·kg-1，全磷含量 0.09 g·kg-1，全钾含量 1.70 g·kg-1，速效氮含量 10.7 g·kg-1，速效磷含量 14.8 g·kg-1，速效钾含量275.7 g·kg-1。果园均管理水平成熟，耕作方式为旱作，种植的苹果树种为半矮化的红富士。

1.2 试验设计

为保证材料的一致性，试验用材料为2009年3月底种植于杨凌苹果试验基地的白三叶。2014年5月底，将白三叶(孕蕾期)刈割后装入尼龙袋(20 cm × 20 cm)中，每袋装鲜草 200 g。同时，为了定量测定白三叶的养分释放速度、土壤养分变化以及减少田间操作对试验的影响，也为了便于与同期进行的覆盖试验进行比较，在苹果树行的中间位置，每隔一定距离，挖深40 cm、宽30 cm的沟，将沟内取出的土壤混匀后，先在容器(直径40 cm、高 40 cm的营养钵，底部有孔)内装入15～20 cm深的土，将装有白三叶的尼龙袋放入容器中，每个容器中放一个尼龙袋，然后用土把容器装满，容器表面与周围地面保持平整，即白三叶埋深15～20 cm。对照为不放白三叶的土壤装满容器，5次重复。

前期研究表明，埋置的白三叶大部分物质降解在前3个月，完全降解约需要12个月(待发表)。因此，分别于埋置后1个月、3个月、6个月和12个月进行土壤样品采集。采集时，取尼龙袋下方约5 cm深的土壤，除去可见植物残体及土壤动物，混匀后采用四分法留取土样，用无菌自封袋封装，放入装有冰袋的保温箱，运回实验室。样品置于实验室自然风干后用于土壤酶活性测定。

1.3 测定指标及方法

土壤酶的活性测定参考关松荫[20]的相关方法。蛋白酶采用茚三酮比色法测定，以24 h后1 g土壤中NH2-N的质量(mg)表示；蔗糖酶采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定，以24 h后1 g土壤葡萄糖的质量(mg)表示；脲酶采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定，以24 h后1 g土壤中NH3-N的质量(mg)表示；碱性磷酸酶的活性测定采用磷酸苯二钠比色法，以24 h后1 g土壤中释放出的酚的质量(mg)表示，3次重复。

1.4 数据处理

使用 Microsoft Excel 2016 对数据进行初步处理，使用SPSS 18.0软件对土壤含水量和酶活性进行差异显著性分析，对土壤酶活性与日均温、月均温及土壤肥力进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 埋置白三叶对苹果园土壤含水量的影响

埋置白三叶后苹果园土壤含水量增加。无论在洛川还是在旬邑苹果园中，埋草的土壤含水量均高于对照，且除埋置6个月时埋草与对照之间差异不显著外，其余埋草处理均显著高于对照(P＜0.05)，特别是在埋置后1个月时土壤含水量增加最多，洛川和旬邑土壤含水量分别较对照增加6.4%和4.3%(图 1)。

2.2 埋置白三叶对苹果园土壤蛋白酶活性的影响

苹果园中埋置白三叶的12个月内，均会使土壤蛋白酶活性显著升高(P＜0.05)(图2)。不同地区苹果园中土壤蛋白酶活性的变化不同，在白三叶埋置前3个月，洛川和旬邑苹果园中土壤蛋白酶活性升高幅度基本一致，但在埋草6个月和12个月时，洛川苹果园中土壤蛋白酶的活性较对照分别提高 0.17 和 0.14 mg·(g·d)-1，而旬邑苹果园中土壤蛋白酶的活性仅提高 0.04 和 0.05 mg·(g·d)-1。

图1 埋置白三叶对苹果园土壤含水量的影响Figure 1 Effect of buried white clover on soil water content in apple orchards

图2 埋置白三叶对苹果园土壤蛋白酶活性的影响Figure 2 Effect of buried white clover on soil protease activity in apple orchards

2.3 埋置白三叶对苹果园土壤脲酶活性的影响

苹果园中埋置白三叶后，除旬邑6个月时埋草和对照之间无显著差异外(P ＞ 0.05)(图3)，在白三叶埋置的其他时间，洛川和旬邑苹果园土壤中脲酶活性均较对照增加，且差异显著(P＜0.05)。埋草对洛川苹果园土壤脲酶活性的影响较旬邑的大，在3个月和6个月时，洛川处理较对照分别增加0.13和0.07 mg·(g·d)-1，而旬邑分别增加 0.04 和 0.01 mg·(g·d)-1。

图3 埋置白三叶对苹果园土壤脲酶活性的影响Figure 3 Effect of buried white clover on soil urease activity in apple orchards

2.4 埋置白三叶对苹果园土壤蔗糖酶活性的影响

苹果园中埋置白三叶后，使两地苹果园土壤蔗糖酶活性在12个月内均较不埋置白三叶的对照增加。同时，埋置白三叶后3个月内苹果园土壤蔗糖酶变化较大。埋置白三叶后土壤蔗糖酶活性较不埋草的对照显著升高(P＜0.05)。埋草后，在旬邑、洛川两地苹果园中，蔗糖酶活性的变化幅度基本一致，在埋草后3、6和12个月时，两地埋草较对照均分别增加约 1.1、0.6 和 0.5 mg·(g·d)-1(图 4)。

图4 埋置白三叶对苹果园土壤蔗糖酶活性的影响Figure 4 Effect of buried white clover on soil sucrase activity in apple orchards

2.5 埋置白三叶对苹果园土壤碱性磷酸酶活性的影响

苹果园中埋置白三叶后，能使苹果园土壤碱性磷酸酶活性升高，且在白三叶埋置的后期(6～12个月)，对土壤碱性磷酸酶活性的增加更明显。在洛川苹果园，埋置白三叶会使土壤碱性磷酸酶活性升高，除3个月时处理和对照间差异不显著外，其余时间均是埋置白三叶的土壤碱性磷酸酶活性显著高于(P＜0.05)不埋白三叶的对照，尤其是6个月和12个月时，较对照分别增加61%和233%。在旬邑苹果园中，除1个月时不埋草的对照土壤碱性磷酸酶活性较埋置白三叶的高外，其余时间均是埋置白三叶的土壤碱性磷酸酶活性高于不埋草的对照，但是3个月时处理和对照之间无显著差异，而6个月和12个月时，埋置白三叶的土壤碱性磷酸酶活性较不埋草的对照显著升高(P ＜0.05)。6个月以后，洛川苹果园埋草处理的碱性磷酸酶活性较对照增加幅度大于旬邑苹果园的，尤其在12个月时，洛川酶活性增幅是旬邑的2.8倍(图 5)。

图5 埋置白三叶对不同地区苹果园土壤碱性磷酸酶活性的影响Figure 5 Effect of buried white clover on soil phosphatase activity in apple orchards

2.6 不同土壤酶活性相关性分析

相关性分析表明(表1)，土壤蔗糖酶和脲酶之间存在极显著的正相关关系(P＜0.01)，相关系数为0.664。土壤碱性磷酸酶与蛋白酶、蔗糖酶之间呈正相关关系，而土壤蛋白酶与脲酶、蔗糖酶之间呈负相关关系，但均不显著(P ＞ 0.05)。

2.7 酶活性与土壤含水量、日均温、月均温的相关性分析

当日的平均温度、当月的月平均温度与土壤蛋白酶、脲酶和蔗糖酶活性相关性均未达显著水平，而与碱性磷酸酶显著负相关关系(P＜0.05)(表2)。土壤含水量与蛋白酶、蔗糖酶活性呈负相关关系，但相关性未达显著水平；与脲酶、碱性磷酸酶活性呈显著 (P＜0.05)和极显著正相关关系 (P ＜0.01)。各种酶活性与土壤有机质、速效和全效氮磷钾均呈正相关性，且速效氮与脲酶，速效磷与蛋白酶、脲酶、酸性磷酸酶，全氮与蔗糖酶相关性达显著 (P＜0.05)或极显著水平 (P＜0.01)。

表1 4种土壤酶活性的相关性分析Table 1 Correlation analysis of four soil enzyme activity

表2 土壤酶活性与日均温、月均温及土壤肥力的相关性分析Table 2 Correlation analysis of soil enzyme activity, daily and monthly mean temperature, soil fertility

3 讨论

苹果园中埋置白三叶后引起土壤酶活性升高与土壤微生物、动物及白三叶的添加有直接的关系。土壤酶主要来源于土壤微生物的分泌，其次是动、植物的分泌及其残体的腐解[21]。白三叶降解影响土壤酶活性，究其原因，首先，植物残体在腐解的过程中可以向土壤释放酶，引起土壤酶的升高[20]。埋置的白三叶是新鲜的茎叶，其对土壤酶的影响较干枯的植物残体对土壤酶的影响可能更明显；最后，植物残体的降解，影响土壤的质量及生态条件。如玉米(Zea mays)秸秆还田后，土壤孔隙度增加，土壤容重下降，土壤通气与水分状况显著改善[22]。郑思俊等[23]对上海外环线绿化带8个具有凋落物的人工植物群落研究表明，具有凋落物的群落其土壤最大持水量、总孔隙度、土壤通气性等均显著高于裸地。苹果园中埋置白三叶后，土壤的理化性状也会受到影响，这直接改变了土壤微生物和动物的生存条件，使微生物和动物的繁殖和活动加强，从而造成土壤酶活性的升高；再次，土壤肥力状况与土壤酶活性也有直接的关系[24-25]。植物残体降解后，可释放大量的营养物质，引起土壤肥力的改变，如土壤氮、磷、钾、有机质及微量元素等均会发生变化[26]，而土壤肥力与土壤微生物的多样性及数量有直接的相关性[27-28]，土壤微生物的变化最终会引起土壤酶活性的变化。

而在白三叶不同的降解时期，土壤酶活性变化存在差异，这可能与白三叶在不同的降解阶段释放的营养物质的量和速度有关。白三叶在埋置降解的前3个月，主要释放的是糖类、蛋白质，而后期主要是纤维素、木质素，因此，土壤中利用这些营养物质的微生物种类前后也有差异，最终引起土壤酶活性的变化[29]。如蔗糖酶，在白三叶降解的前期较高，而在后期却越来越低，可能也与白三叶营养物质释放的不同有关，这一结果也与对白三叶降解过程中土壤微生物的研究结果[29-30]一致。

当然，试验地点不同，环境温度、湿度、土壤养分等条件也不同，自然会影响土壤微生物、动物的活动及白三叶的降解与养分释放速度，从而最终会使土壤酶的活性有差异。洛川和旬邑虽都处于渭北高原，但两地的海拔、年降水量、日照时数、土壤类型都有差别。本研究表明，埋草后，洛川苹果园土壤酶活性变化较旬邑苹果园的大，为了探究其原因，就采样时的日均温、月均温、土壤含水量、土壤肥力与土壤酶活性进行了相关性分析，发现相关性因酶而异。碱性磷酸酶活性与日均温、月均温显著负相关，这可能因为此酶的活性和白三叶降解后对土壤养分的影响关系更大，有研究表明，在苹果园覆草6个月后碱性磷酸酶活性和速效磷含量显著正相关[29]，可能导致埋置白三叶后对土壤酶的影响有差别；脲酶、碱性磷酸酶活性与土壤含水量显著正相关，在一定程度上说明埋草后土壤碱性磷酸酶活性增加与埋草能提高土壤含水量密切相关；土壤肥力与各酶活性正相关，说明埋草后土壤肥力的提高对酶活性的增加有重要作用。而埋置地区洛川和旬邑，气温、土壤含水量、土壤肥力等均存在差异，导致未埋草时，洛川苹果园蛋白酶活性普遍高于旬邑的，蔗糖酶、脲酶。碱性磷酸酶活性低于旬邑的，但埋草后，洛川土壤酶活性变化却大于旬邑的。这一方面说明在果园草埋置时也应根据地区的不同选择合适的埋置时间和最佳的白三叶埋置量进行埋置；另一方面，影响酶活性的变化原因众多，不是一种因子能决定的，而是多种因子综合影响的结果，探究其原因还需对影响因子进行更为系统的研究。

土壤酶也是土壤中各种生物化学反应的催化剂[31]，植物残体的降解反过来又是在土壤中各种酶的共同作用下完成的[31-32]，因此，土壤酶活性的高低，也表征了植物残体的分解速率及各养分元素的释放与转化速率[33-34]。如徐秋芳等[35]对杉木(Cunninghamia lanceolata)、马尾松(Pinus massoniana)和檫树(Sassafras tsumu)凋落物室内混土培养的结果表明，3类凋落物分解均能显著增加过氧化氢酶、脲酶、纤维素酶和多酚氧化酶的活性，其中檫树处理的过氧化氢酶和脲酶活性最强。Sinsabaugh等[36]对木材分解过程中土壤酶活性的研究表明，土壤酶在木材分解和氮磷元素的释放过程中起着重要的作用。而土壤蔗糖酶与有机质的转化有关，磷酸酶与土壤有机质及P养分的循环状态有关[21]。因此，从白三叶降解过程中蔗糖酶的变化就可预知，白三叶的添加，可提高果园土壤有机质。而从土壤碱性磷酸酶的活性变化可知，白三叶中的磷元素在降解的前期转化较慢，在后期转化较快。同时，本研究表明，土壤脲酶与蔗糖酶之间存在极显著的正相关关系，也印证了土壤酶在参与反应时不仅具有特定的专一性，还存在着一定的共性，而这些具有共性关系的土壤酶类的总体的消长在一定程度上反映了土壤肥力水平的高低[37]。

4 结论

苹果园中埋置的白三叶降解后能提高土壤蛋白酶、脲酶、蔗糖酶和碱性磷酸酶的活性，但此作用与苹果栽培地区和白三叶降解时间有一定的关系。对土壤蛋白酶和碱性磷酸酶的作用在6个月之前小于6个月之后，而对蔗糖酶的作用降解6个月之前大于6个月之后；埋草对洛川苹果园的影响较旬邑苹果园大。